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标题: 求助，关于脐带间充质死活爬不出来... [打印本页]

作者: 听不到 时间: 2015-5-31 16:03 标题: 求助，关于脐带间充质死活爬不出来...

取了3根脐带，去完血管后剪碎贴壁处理，养了大概20天了，镜下看是这样的，感觉都能看见细胞了，但是就是没爬出来，哭了都要，3根脐带应该也不存在哪个脐带有问题的事啊。求帮忙分析下原因以及解决方法[attach]69763[/attach][attach]69762[/attach]

作者: chimo100 时间: 2015-6-1 08:25

你应该把用的什么试剂，操作方法写清楚了，别人才能帮你分析啊

作者: levell 时间: 2015-6-1 09:06

1、剪脐带的时候要把上面有一层筋膜撕掉再剪，尽量剪成1mm3的组织块) n [) U' q2 I4 z! T
2、如果能消化一下效果肯定更好

作者: journey07314 时间: 2015-6-1 09:24

操作步骤最好写清楚点。一般贴壁培养后7天左右一次换液，14天二次换液的时候细胞差不多都爬出来了。

作者: zxkll 时间: 2015-6-1 09:26

本帖最后由 zxkll 于 2015-6-1 09:27 编辑 . v* l# a# D4 g6 I$ ~7 U8 f

mark一下$ w; i( z0 {- J% F8 J9 D/ j
前来学习

作者: 听不到 时间: 2015-6-1 09:37

操作步骤就是正常的去三条血管，剪碎后于玻璃瓶中倒置过夜，第二天正过来并加入培养液（DMEM+10%FBS+1%双抗），然后就基本上是过个2，3天换一次液。但是到现在都爬不出来。以前我也不去羊膜，但是长得就挺好，快的7天就爬出来了，但这次死活长不出来。至于酶消化，我从来就没成功过...我是用1mg/ml的I型胶原酶，将去完血管并剪碎的组织块进行酶消化，37度轻摇消化，3,4h以及过夜我都试过，胶原酶消化完之后加胰酶在消化半小时我也试过，但还是收不到细胞，现在快要被细胞逼疯了。实验方案一大堆，但是没有细胞啥都做不了

作者: baicaikua 时间: 2015-6-1 10:02

一般会将华通氏胶剪成肉糜状，然后混合培养基放在培养箱里就好了啊。没什么特殊的，样上后就轻易不要动了。7天后将培养皿略倾斜，洗出培养基，在缓慢加入新培养基。感觉关键点是间充质干细胞是贴壁生长的，所以组织块要贴在培养皿上，不要频繁晃动，要是把组织块晃的漂起来会影响细胞爬出的速度。至于培养基没什么太大的要求，最基本的培养基就可以养，比如DMEM/DMEM-F12/1640什么的都可以养的出来。! q! }; |. x  |, p
   总结：组织块能剪多碎就剪多碎。如果需要可将组织块均匀放于培养皿上1~2小时等与培养皿黏牢后再缓慢加入，不要使组织块漂浮，（可以相像水里的暗礁那样）又或者可以用少量FBS先铺板再加组织块（放置组织块飘起），然后再加培养基，一切加好后放培养箱里。一周后再换液，动作轻柔缓慢。一般两周可以出细胞了，最多3周吧。还有加双抗影响细胞的长出速度。还有看你第二张图好像细胞出来了啊。
   如果以前的细胞都长得出来就这次的长不出来，正常只有两个可能，培养基和组织块的问题。
   1. 培养基是成品还是用粉剂自己配的。成品的话是不是过期了，保存是否得当，粉剂的话除了过期和保存的问题，PH调好了么？3 k1 U# K& B9 C' b
   2. 组织块是新鲜的还是冻存的，会不会冻坏了？冻存过的组织块就算是好的，爬出的速度也比新鲜的慢大约一周左右的样子。0 q' w5 H! W: G# E& W. ?+ U0 `

作者: baicaikua 时间: 2015-6-1 10:06

补充下你用胶原酶消化的话3~4小时时间实在是太长了。过夜的话一般是冷消化。但是就我的很多实验结果看来，冷消化用处不大。

作者: journey07314 时间: 2015-6-1 10:30

组织贴壁到你加培养基的时间稍长，我们一般是倒置贴壁两个小时左右就加培养基了。

作者: 听不到 时间: 2015-6-1 16:49

回复 journey07314 的帖子

但我在剪碎组织的时候是把组织浸在培养液里的，所以没加培养液就过夜了。而且重点是我之前这样做长出来的细胞很好的，不知道这次为啥就不行了

作者: 听不到 时间: 2015-6-1 16:53

回复 baicaikua 的帖子. u8 ]5 x$ V/ R. J& H' w1 }

谢谢你回答啊~) ?) y O2 s; z$ h/ f! [" x! t& H
看第二张图片我也觉得是细胞马上就要爬出来了，但这个状态已经很久了...至少得5天了...在组织块周边看不到一个细胞，所以完全就是舍不得扔但是还得不到细胞╮(╯▽╰)╭
我培养液基本是没有问题的，整个实验室都用的这个，别人都没事，组织块是当天取的，应该没有什么问题，我再等等吧就
还想问下，你用胶原酶消化能得到细胞吗？我试了很多次了，怎么都得不到细胞。

作者: journey07314 时间: 2015-6-1 17:12

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我们一般是不加培养液直接剪碎组织，剪好后再加入培养基混匀组织，转入培养瓶正置培养，六七天才换一次液。组织不要剪太大，太大的话细胞爬出来比较慢，太小的话又贴不住容易漂，这需要自己摸索。还有就是我们以前加抗生素的时候加了两倍，细胞没长出来。

作者: baicaikua 时间: 2015-6-1 17:58

加培养基再剪是因为组织块剪刀后面太粘稠，加点培养基稀释下好剪点，华通氏胶没消化过，因为很好爬出来的。脂肪我用胶原酶消化过。能长出来还很好呢。不过消化时间比你短很多，浓度也低很多，是用恒温摇床消化的。组织不一定要等到全部消化没了才算消化好，组织还剩很多的时候，其实已经有很多脱落的细胞在消化液里面了。收集消化液里面的细胞就可以了

作者: 听不到 时间: 2015-6-2 11:14

回复 baicaikua 的帖子5 M6 A! X) o7 a% {8 n, r& u/ v
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我觉得我肯定消化下来了，但是收集步骤这里出了问题应该是。我收集的时候基本是消化液总共大概4,5ml，添PBS至45ml后2500rpm，20min，弃上清，留大概4,5ml液体，继续加PBS至45ml，离心1500rpm，15min，弃上清，留大概4,5ml液体，继续加PBS至45ml，离心1000rpm，10min，弃上清，培养液重悬，发现没有细胞...

作者: deshenglll 时间: 2015-6-2 11:54

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' J: a- Q7 ?' S$ C3 A: B, } [
不用倒置，不用加双抗。正常情况3-5天就可见细胞。

作者: deshenglll 时间: 2015-6-2 11:54

回复听不到的帖子0 Q( A# ~) P1 R' L. ]
1 s2 u, R( [( \+ Q! {) U
玻璃瓶不利于组织块贴壁

作者: baicaikua 时间: 2015-6-2 14:26

回复 deshenglll 的帖子" y- y0 b. P3 R* O
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3~5天就能看到细胞怕出来有点太快了吧。

作者: baicaikua 时间: 2015-6-2 14:26

回复 deshenglll 的帖子5 a7 e! o( Y& f9 O& `7 ?" n

3~5天就能看到细胞怕出来有点太快了吧。

作者: baicaikua 时间: 2015-6-2 14:35

回复听不到的帖子7 j0 f9 p- D- R" B1 I

看不出来收集步骤有问题啊。我都1000RPM10MIN。。。而且就洗两次。消化后消化液变浑浊么？还是变的很粘稠，酶是不是OK的？收集消化液用筛网过滤么？过筛网前先加PBS稀释吹打下，要是粘度很高筛网可能会截流大量细胞，有时会有一半。。不过也不至于完全没细胞。。还是觉得消化时间太长，把细胞都消化掉了。

作者: suning5 时间: 2015-6-2 15:10

黑丝像脐带间充质，消化一下看看

作者: 听不到 时间: 2015-6-3 09:10

回复 suning5 的帖子
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怎么消化？求方法。我用酶消化法怎么都得不到细胞，所以不敢随便消化

作者: 听不到 时间: 2015-6-3 09:12

回复 baicaikua 的帖子

消化液很粘稠，稍微浑浊，不是很浑。酶没有问题的。我没用筛网过滤，就PBS稀释完后我离心完取一点下层液体，也看不到细胞...消化时间这里，我也试过3,4h啊，也还是没有细胞...现在整个不敢试酶消化法啊

作者: 听不到 时间: 2015-6-3 09:12

回复 deshenglll 的帖子1 n! I' E( [7 G

我从来没在3——5天发现过细胞，最快是7天啊

作者: baicaikua 时间: 2015-6-3 09:29

回复听不到的帖子1 t# @' C) a l# i% s( }1 |
8 H8 z) A1 Z, g. X
很粘稠有类似果冻状么？稀释完后有没有用枪头吹打？消化3~4小时感觉还是长了1~2小时可以试试，不过就算3~4小时也不会完全没细胞啊。是不是消化液里粘稠的东西没吹开，包裹了细胞结果没离心下去？

作者: 309208770 时间: 2015-6-3 15:05

回复听不到的帖子1 Z6 }( J. p8 W1 Y* n

我也用的这个方法，想问一下为什么要将瓶子倒置？4 H7 U' w! I9 @

作者: hefan1234 时间: 2015-6-3 15:44

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不知道楼主是怎么操作的，我们实验室剥离华通氏胶后剪碎成小颗粒块然后加少量培养基直接种瓶，3-4天换液，一般10天左右细胞就爬出来了，12天左右就可以传代了。酶消化法的话就更快了，一般8左右就可以传代了，不过我们胶原酶消化后不用胰酶消化。

作者: hyg5481655 时间: 2015-6-3 16:02

回复听不到的帖子8 M- E u$ Y: J* l3 ~

1. 你剪得块要足够小，其次把块放到培养皿里之后不要马上给培养基，放培养箱倒置45分钟左右，时间不要太长6 s& ]0 z3 X- _$ I
2. 给培养基沿着边慢慢加，不要给太多，能没过块就好，加完不要晃动。& y& e& G4 J0 i! v
3. 血清不行，这个影响是巨大的，爬出来的细胞有可能在块的底部，但是时间这么长看来是增殖很慢，有可能是血清营养不够，我们这里一星期就爬出来而且很多了。

作者: deshenglll 时间: 2015-6-4 10:03

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那是操作手法的问题。我们养的最快7点可传代，9天冻存。

作者: deshenglll 时间: 2015-6-4 10:05

回复 baicaikua 的帖子, ~0 l/ w+ G7 f% i" p* ]

很正常阿。我们做库的从制备到冻存在12天，上下浮动一天。

作者: 月_幻影 时间: 2015-6-4 10:45

我觉得LZ应该检查一下培养箱，如果你的操作过程和试剂都没有什么问题的话，很有可能是培养箱出现问题了，比如气体、水量、温度等因素。。。

作者: 听不到 时间: 2015-6-5 12:49

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类似果冻状的，稀释后没用枪头吹

作者: 听不到 时间: 2015-6-5 12:50

回复 309208770 的帖子

促使贴壁嘛，剪的时候往里加点培养液，加一点就好，加多了会导致倒置的时候组织块掉下来

作者: 听不到 时间: 2015-6-5 12:52

回复 hefan1234 的帖子- R0 a! v/ c8 w. w# T- Y; k1 A

我和你不一样的就是种瓶后倒置过夜，然后第二天再加培养液，其他差不多，以前也是10天基本就长出细胞了，但是这次不长...话说你用的瓶是塑料瓶还是玻璃瓶？

作者: 听不到 时间: 2015-6-5 12:53

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那你看我之前发的具体步骤上有什么需要注意的吗？

作者: 听不到 时间: 2015-6-5 12:56

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应该不是，培养箱是实验室公用的，别人都没问题，不过他们养的是肿瘤细胞

作者: caustic 时间: 2015-6-5 15:26

回复听不到的帖子7 N+ d# ?" ~ K5 {2 W7 J& e% W4 _

既然你原来的操作都能养出来细胞，就证明应该不会是操作或是培养基的问题了很可能是标本本身的问题，说实话，我们实验室也不是每份标本都能养出来，每份标本都有个体差异，就是说很可能有的胎儿脐带活性很好，而有的活性就很低，还有就是脐带采集过程中有没有什么问题比如采集后暴露在空气中时间过长影响脐带细胞活性等。

作者: hefan1234 时间: 2015-6-5 16:01

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用的是NUNC的塑料培养瓶，既然你以前倒置培养过夜培养很正常，那这次有什么变量因素吗？比如脐带来源个体是否正常，运输过程中温度、保存液是否正常，本次使用的培养液是否检测正常？

作者: 刘芳hh 时间: 2015-6-5 16:29

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有没有去除脐动脉？

作者: deshenglll 时间: 2015-6-6 11:00

回复听不到的帖子) d" {, l& ~5 T0 e; Y) @- d

你的操作步骤我看了。不用倒置过来。这种倒置的方法早就过时了。你就把剪碎的组织块接种到瓶里（组织块大小合适，培养基添加量要合适），还有就是不用加什么双抗，用酒精消毒一下就行了。我都做了好几千份了，都没用过双抗，污染率挺低的。

作者: 听不到 时间: 2015-6-7 10:51

回复 caustic 的帖子

我这次是一次性做了三个人的，所以我认为不应该是个体的问题，至于采集后应该是放在4度保存了，然后师弟去取的

作者: 听不到 时间: 2015-6-7 10:52

回复 hefan1234 的帖子
2 k/ D* N* @, T% ^. a" }8 {/ p
现在看来可能就是运输过程中出问题了？师弟取得，我也不清楚过程中如何，但之前他也取过，都没问题...

作者: 听不到 时间: 2015-6-7 10:52

回复刘芳hh 的帖子
) ]. ^4 `6 o C, r: @' Y: N
当然去除了...

作者: 听不到 时间: 2015-6-7 10:53

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( Q8 B5 B! w, z. ~: R/ T
酒精消毒不会损伤细胞活性吗？种到瓶里之后就不动了吗？几天换液呢？直接这样整我怕漂呀

作者: 蜗牛爱贝贝 时间: 2015-6-8 13:59

回复 baicaikua 的帖子. k( I* D- z6 @# e2 r/ m9 `

培养基不要放得太多，就好了，要保证组织块挨着培养瓶底

作者: 月_幻影 时间: 2015-6-8 15:30

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不过肿瘤细胞相对于MSC来说更好养一些，还是建议LZ把所有的细节捋一遍，再就是虽然取了三根脐带但不排除存在个体差异，不行LZ可以重新取脐带进行培养操作。

作者: deshenglll 时间: 2015-6-9 14:00

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$ c8 z' @ V2 u f* t
酒精消毒不会损伤细胞的。种在瓶里后看情况换液（视培养基消耗情况而定）。只要培养基别加太多，组织块剪的大小合适就没事。

作者: zhang0194 时间: 2015-6-21 15:15

回复听不到的帖子4 w$ L5 M% G. ^- i, \; g

表皮要去掉的，你显微镜下黑色的部分就是表皮，并且不去表皮杂细胞就多，不适合传代！

作者: 舞时 时间: 2015-7-16 08:46

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' C4 o9 i; E7 S$ u5 h
我们只剪华通氏胶剪碎加培养基培养一周不能动的

作者: nkcell 时间: 2015-7-16 11:06

我养过很多的期待间充质细胞，对于你这种情况我遇到过，主要的原因是培养基的问题，你换成GIBCO的特级胎牛血清和A-MEM,就可以了

作者: nkcell 时间: 2015-7-16 11:08

现在细胞还是很不错的，希望你早点处理，离心重悬用GIBCO的特级胎牛血清和A-MEM重新培养，很快就可以长出细胞来了

作者: 听不到 时间: 2015-7-17 10:20

回复 zhang0194 的帖子) i; w0 D2 f+ l, P, M2 i

可是表皮真的很难去啊...

作者: 听不到 时间: 2015-7-17 10:20

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$ L, |& A' a$ u1 _; ^7 L+ m7 ?
谢谢啊~我现在用LG-DMEM加gibco血清能行么？

作者: nkcell 时间: 2015-7-17 11:42

最好用GIBCO的MEM和特级胎牛血清，一定没问题

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