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标题: 今天第一次尝试提取脂肪干细胞，貌似不太成功 [打印本页]

作者: Cyclone2009 时间: 2015-5-31 20:01 标题: 今天第一次尝试提取脂肪干细胞，貌似不太成功

养细胞新手，今天第一次做了大鼠脂肪干细胞的原代培养，有些疑问，求专业人士指教。。6 ?; f5 B t% a8 N
1. 我是取得SD大鼠腹股沟区的脂肪组织，大剪刀剪碎，然后眼科剪剪8分钟，看起来像浆糊样。然后用1型胶原酶，0.1%，量大约为脂肪体积的2倍，37度摇床45-60min消化。消化完成后，加入等体积培养液中和，吹打的时候发现很难吸上来，应该是内容物太粘稠了（用的一次性的塑料10mL 移液管）,是不是说明剪的不够碎，或者胶原酶加少了？另外，想请教下如何判断有没有消化好呀？! _. Y8 |# I: h% y$ g/ w
2.中和后1000rpm 10min。发现最上层是脂肪，离心管底部有灰白色的絮状物。基本没有牢靠固定于底部的沉淀。。这是什么原因呢？还是细胞是在这些絮状物里面？
3. 然后我重悬了离心管底部的这些东西，100um细胞滤网过滤，1500rpm 5min. 发现离心管底部也只有很少的沉淀，仍然看上去像絮状物。硬着头皮往下做，10ml培养液吹打，接种。。
4.显微镜下看到不少大的小的亮点，感觉像脂肪滴。。请问下是不是当天看不到细胞状的东西？那一般几天可以看到细胞贴壁呢？9 X, L2 o9 Z# i3 V& Y
5.上述就是我的基本步骤，是不是有不对的地方呀？特别是第2和3部，希望高手能够指点。。

小白跪谢！！！

作者: 夜光猫 时间: 2015-6-1 11:52

我们还会加0.1%的胰酶，跟胶原酶一起消化。离心的时候用的1500rpm，10min。+ C/ [' p4 a/ ~- p5 N+ |4 j* [
我们一般到第二天换液的时候再看贴壁细胞的多少* }/ Q) G) z+ ~* {; Z% I
祝好运

作者: saier.HK 时间: 2015-6-2 11:45

楼上说的加0.1%的胰酶是可以的，这样能够消化的更好；
你的培养瓶可以用多聚赖氨酸先铺一下，这样细胞容易贴壁；+ |; o: Z' F( @0 U! P! t8 `& c
不用过筛也行，因为有时候那个组织也能够贴壁，细胞能从组织里爬出来，这些细胞也很纯； T$ f7 ~" b# y0 J" G. I# C
一般2-3天就能看到细胞贴壁，这时候可以换全液，如果贴壁细胞不太多，可以换半液。祝你好运！

作者: deshenglll 时间: 2015-6-2 11:50

回复 Cyclone2009 的帖子

可以考虑用培养基配胶原酶。还有就是过滤可以考虑用输血器

作者: suning5 时间: 2015-6-2 14:58

说对了，白色絮状物内有细胞

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