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标题: 原代培养脂肪来源的间充质干细胞-day3 [打印本页]

作者: Cyclone2009 时间: 2015-6-3 10:52 标题: 原代培养脂肪来源的间充质干细胞-day3

本帖最后由 Cyclone2009 于 2015-6-3 10:52 编辑

第一次做脂肪干的原代培养，贴了两张图（图一，二），都是提取后第三天的。大家看看像脂肪干么？当然后面我要做三向分化和流式的。
首先LZ犯了一个错误，一只SD大鼠提取的脂肪组织大约3-4ml，是不是最后接种在T25的flask培养比较好？我没有注意到种在了T75的flask，导致密度特别稀，是不是不太好养活了呀？7 Q: C, \, J$ m4 l5 q
另外想请教两个问题：
1. 我是用0.1%I型胶原酶，量为脂肪体积的两倍，这个量合适么？嫌多么？. `0 U" m* T2 h& j |/ W
2. 我是在37℃的空气摇床上摇1h消化，摇床的转速是220转/min，是不是太大了，把细胞都摇碎了？调整成100r/min不知道可不可以？
图一：/ n, M8 ?) X; ~9 u9 {% y. ^+ @) A" i
[attach]69807[/attach]
6 y( R: b8 H9 v5 |) p. f& r
图二：# v# N6 p+ Y' w+ t0 A; T9 _
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8 Z, f: k0 U7 D+ f7 P$ a& L
图三：我在flask还看到这些个东西，感觉类似于铺路石，是晶体还是内皮细胞也贴壁了呀？3 r- D- m' Z! X2 O i5 s7 R
[attach]69809[/attach]& W5 H$ q1 W6 T" l* [
$ _) B( g: }9 M' Q
图四：这个是实验室一个staff做的脂肪干，现在是P3，怎么细胞形态像蜘蛛一样的多角形，梭形的很少，是细胞不好了么？请专业人士指导呀？) v! t1 S' _" k* m7 r: f0 \+ t) Y& T
[attach]69810[/attach]. b9 W+ s7 k6 A' _/ ?

谢谢！！

作者: saier.HK 时间: 2015-6-3 11:17

1.那个浓度的胶原酶可以；( F+ R( n+ I: O' G1 O5 r
2.最好37℃水浴摇床，这样效果更好；2 q+ C$ u% G4 d4 Y" S% I( C
3.明显细胞太稀，刚开始最好种的密度大些；
4.细胞太杂，并且细胞好像缺营养，15%FBS DMEM较好（个人经验）；
5.这个细胞量肯定不够你后续的实验用。祝你好运！

作者: hefan1234 时间: 2015-6-3 11:56

1.胶原酶浓度还可以；
2.我们实验室也是37℃摇床，不过转速是150r/min，30min（主要看你的胶原酶效果好不好，效果好的话半个小时差不多了）；* [1 J6 E( w% H$ l5 L9 e, ]
3.细胞的确中的太稀了，建议开始种T25的培养瓶；
4.同楼上，也是用的含15%胎牛血清的培养基；

作者: Cyclone2009 时间: 2015-6-3 12:05

回复 hefan1234 的帖子$ A, s& Y/ b: E7 g! F) D- k$ ? }
- X2 j( c5 e# | R3 }: j- L }2 F
感谢呀。。
想问下你们是如何判断脂肪消化的差不多了的呢？. n$ Z% x! m1 Y8 C
乳糜状？

作者: hefan1234 时间: 2015-6-3 14:50

回复 Cyclone2009 的帖子

是的，差不多乳糜状，主要是脂肪小团块都被消化掉就差不多了，消化太久脂肪干细胞活性变差。我们培养的是人脂肪干细胞，脂肪块消化前经过清洗剪碎，发现消化过头的脂肪干细胞活性不好且容易提前老化。你做的小鼠脂肪干细胞，看图片主要原因应该是种的太稀了，没贴壁的细胞有但不是很多，所以不能判断是否消化时间过长或转速高导致细胞活性低。

作者: Cyclone2009 时间: 2015-6-3 15:17

回复 hefan1234 的帖子2 z9 S; m1 g, S' q, g# H1 G
+ ]9 Y1 b2 a# p; ~1 ~
恩，十分感谢指点。
我觉得可能是种在T75 flask的原因么。提取的脂肪就3-4mL，种那么大的flask应该会导致细胞密度太稀了吧。。3 h# u9 n9 C1 h+ {( l' {: C( i/ r
下次准备用T25 flask接种。。
再次感谢啦！！

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