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标题: 造血干细胞流式检测结果分析 [打印本页]

作者: SKC-SFC 时间: 2015-6-3 16:23 标题: 造血干细胞流式检测结果分析

各位大侠，我们实验室目前在做造血干细胞的鉴定。采用流式细胞仪检测，选择的标志物是CD34+CD45+CD133.2 b3 d# n9 S8 B% p) O
方法是：标记去红后，用CD45/SSC画R1门，圈定白细胞-画CD34/SSC双参数图，显示R1门，画R2,-建立CD45/SSC双参数图，显示R2门，画R3门-建立FSC/SSC散点图，显示R3画R4门-回到R1门所在图，选择CD45阳性最强和SSC最大的位置画R5门-重新确立R4门的位置-画CD34/CD45&CD45+CD133双参数的十字门，确定R1门的临界位置来重新确定R3的位置。
不明白的地方：
1.CD133的必要性
2.最终造血干细胞的统计学数据是R3还是R4的统计学数据？
3.通过R5门来重新确定R4门作用在哪里？
4.我的这个实验思路无问题
求各位大侠指点，谢谢！

作者: SKC-SFC 时间: 2015-6-3 16:31

顶起

作者: nailute1985 时间: 2015-6-4 08:58

1、cd133必要性不是很强，造血干的特异性标记就是cd34+ 所以用双标就可以了。
2、你用的是十字门吧？但是我们做造血干的标记的话是用的逻辑门，大体上是这样的：首先ssc／cd45设门圈有核R1，然后R1里面做cd34+／ssc 圈cd34强阳为R2，然后R2里面做cd45/ssc 圈弱阳cd45为r3，然后r3里面做fsc／ssc 圈弱ssc那部分为r4，r4就是结果。' s+ e, n) S$ A2 h& \
3、楼主选的是强阳性的cd45吗？我觉得应该在cd34＋细胞群中找到弱cd45的那才是真正的造血干，并且在ssc／fsc中也要找出ssc弱的那部分。

作者: SKC-SFC 时间: 2015-6-4 09:43

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首先要谢谢您的回复。
1.选择CD133是老板的意思，因为国外不少文献说，CD34-的那部分细胞也具有造血功能，而且不少国外文献有把CD133加入和协助鉴定造血干细胞。
2.我们这边也是把CD34+中找CD45弱阳性的那群。/ T3 ]/ f, l7 z( ^) J I/ \1 [* K
3.您说您觉得R4就是结果，我一直觉得R3是结果。因为R4不是为了验证这群细胞是否落在幼稚的淋巴群中，只是为了验证？
4.建立FSC/SSC双参数图的真正意义在哪里？; s9 i' ?2 w. p/ `& u4 m) B* y* A
5.设立十字门的目的又对整个结果起啥作用。从实验设计来看，设立CD34+CD45的双参数十字门是为调整R3的位置来设置的哦。; a/ D/ Q3 T% S
6.关于R5门的画定，有时候左边的杂细胞群挺多，R5的位置不是那么好花，很担心是把单核细胞群画进去了。

作者: nailute1985 时间: 2015-6-4 09:57

回复 SKC-SFC 的帖子* \: E- k# H1 r& `* g
7 m, G; f/ H. k7 S
1、你们是研究，我们是临床，所以肯定成本我们会考虑进去，cd133成本会高很多。其实绝大部分的造血干都会表达cd34，剩下的只是极小一部分
3、R3可以基本确定，R4的用意确实是为了验证这群细胞是否在淋巴群里，但是我觉得r4是很有必要的，因为如果你看r4的流式图的话，会发现r4的范围很宽，所以最后圈r4还是有必要的。不能全圈上，不太准。5 E" }3 d1 ]7 B" q# ]# p" A
4、fsc／ssc这个是必须的，无论做哪个标记。这个就是最直观的看三系分区的状态的。1 c J; r: W1 F# l" w
5、其实十字门也不是不可以，但是对于逻辑门来说更合适，十字门分区并不是很准确，会有压线那种情况，不好区分。
6、这个是比较常见的状态，因为这跟你去红去的干净不干净，或者血液本身的质量有很大关系。

作者: SKC-SFC 时间: 2015-6-4 10:10

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1.我们也是临床，只是老板希望我们先累计CD133的数据，通过将CD34+和CD133+的数据进行统计学的分析，若无差异的话，就可以采取CD34+CD45直接进行标记检测并分析。
2.从您表达的意思来看，造血干细胞应该具备以下几个条件：CD34+，CD45弱阳性，这群细胞是位于幼稚淋巴细胞群里？
3.我们画R4门，就是在FSC/SSC的散点图中画的。
4.关于十字门我赞同您的意见。但文献都这么做，不知道是为什么？
5.我们去红还算是非常的干净，有时候做出的我图和文献上一致，结果也好分析，有时候回有左侧拖尾的情况，我们一般是通过调大阈值来去除干扰。因为我们的设备不需要调电压。; V/ G% G1 H' w& w$ @ f
6.最后咨询一下CD34+CD45+CD133做同型对照的实验设计.
谢谢！

作者: nailute1985 时间: 2015-6-4 10:26

2、并不是cd34+和cd45弱阳，而是cd34+与cd45+的那一群圈出来之后，相对再找出cd45弱阳的那些。对，位于幼淋那片2 Y: `1 h; ` X' |7 j2 Z# R
4、十字门在文献中很直观，直接就能看出来双阳或其他的，不像逻辑门，还得一步步分析，文献中是没办法解释的。* m0 }3 Z. U6 z
6、isotype的话，很简单，不就是要去除非特异性的么，所以只要把cd34和cd133换成同性对照就ok了。cd45依然做阳性管9 S/ P; r, X. `$ K

作者: fm100200 时间: 2015-6-4 13:29

学习了

作者: SKC-SFC 时间: 2015-6-4 14:30

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谢谢.

作者: yuanyecat 时间: 2015-6-5 15:56

上图啊没图没真相啊

作者: SKC-SFC 时间: 2015-6-7 10:31

回复 nailute1985 的帖子7 Z3 i2 m) _& d
5 p' B( g! |8 A ~% w2 Y
您好？关于造血干的同型对照实验，我还不是很明白。希望您可以在百忙之中帮我解答一下，万分感谢。我们现在是做CD34+CD45+CD133，请问这三种标志物的同型对照实验怎么设计。然后分析方法呢？我们用的是Accuria C6

作者: nailute1985 时间: 2015-6-7 11:39

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' A: J' K% u# z6 s5 I: x% _
你阳性管实验怎么设计的，对照组就把阳性管加的抗体换乘阴性管就行了。cd45不用换

作者: nailute1985 时间: 2015-6-7 11:40

回复 SKC-SFC 的帖子: z- `0 V4 r8 t( |
_1 | o8 }! d" M2 ^3 V R6 {
比如你阳性管加的是cd34 cd45 cd133的三样对照组就加cd34跟cd133的同型对照 cd45不变

作者: SKC-SFC 时间: 2015-6-8 10:14

CD45同型对照不加吗？那CD45的检测值不需要减去CD45的阴对值吗？

作者: SKC-SFC 时间: 2015-6-8 10:15

按您的涉及方案调荧光补偿怎么调呢？

作者: 细胞海洋 时间: 2015-6-9 09:12

回复 SKC-SFC 的帖子) x5 Z2 j* F/ B1 E: O

你回复谁就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容像我这样

否则他会看不到& d. H! _) L$ U* Y# ^) H

作者: SKC-SFC 时间: 2015-6-9 09:27

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* P! O; k3 d1 u, C. T: h
CD45同型对照不加吗？那CD45的检测值不需要减去CD45的阴对值吗？& a9 j3 B9 A4 ]3 A7 X
按您的涉及方案调荧光补偿怎么调呢？
您若把实验设计发给我，我万分感激。谢谢哈

作者: nailute1985 时间: 2015-6-9 10:13

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$ p* {' U6 \* R8 z
cd45的可以不用加了。因为你去红之后留下的基本都是有核了，cd45的非特异性染色没有必要做，因为不可能出现cd45非特异性染色之后cd34还是阳性的情况了。实验方案这个应该是个商业性的东西了，不好发给你，望谅解。但是我可以告诉你的是cd45的isotype不用做滴。

作者: nailute1985 时间: 2015-6-9 10:14

回复 SKC-SFC 的帖子4 d, y2 h; B2 W: k
' p! E: F. w) B# k/ s+ c
难道你的阳性管没有调补偿就直接做了？如果已经调完了对照是不需要调的如果你调了，连实验平行性都破坏了，还叫做阴性对照不？

作者: SKC-SFC 时间: 2015-6-9 10:45

回复 nailute1985 的帖子: Y$ e i5 t k" O. x
' W% N0 h- p( e7 O8 [$ K
我们是调完补偿后检测，样品管和阴对管分别分析，然后结果是是检测管的值减去阴对管的值就是了。问题是我们的几个通道都远。只有一个需要调补偿。通道间隔远的，比如第一和第四的话都没有调的必要了吧.

作者: SKC-SFC 时间: 2015-6-9 10:54

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这个地方我有点糊涂了。我们以前做表达量高的时候，基本就不做补偿，直接做空白的细胞对照。现在这个造血干细胞因为表达量极低，必须做补偿。我看文献上都说是用同型对照（阴性对照）去调补偿之后，再测定单个的项目？

作者: nailute1985 时间: 2015-6-9 13:41

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! @$ o% [& S. V S0 X( ^
对你是fitc跟pe吗？那你第四个不用调 123都需要

作者: nailute1985 时间: 2015-6-9 13:42

回复 SKC-SFC 的帖子; Z& l8 |' g& v+ ]0 ]* j/ t
) G2 m& O8 ]/ D0 |
你一开始的阴性区的阈值就是用同型对照来调的，所以阴性管你就不需要再调了对不？

作者: SKC-SFC 时间: 2015-6-9 14:41

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. S. G3 d1 H+ p+ z9 R- i0 w7 c
好的，谢谢！您的意思就是：
1.样本品管仲加入待检细胞+CD34-PE+CD45-FITC+CD133-PerCP,对照管加入待检细胞+CD45+CD34-PE和CD133-PerCP的同型对照抗体
2.测定对照管，根据检测情况调补偿和阈值。调至合理范围。通道之间无荧光干扰。% }% m5 X) ]" X( l
3.检测样品管，画3个图FL1,FL2,FL4进行分析。这个时候还需要话FL1/FL2，FL2/FL4，FL1/FL4的十字图吗？

作者: SKC-SFC 时间: 2015-6-9 15:00

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我想了一下应该是这样：/ f3 g* ^4 ^% v) f
1.样本品管仲加入待检细胞+CD34-PE+CD45-FITC+CD133-PerCP,2 T9 [5 @8 H9 `+ C
2.阴性对照管加入待检细胞+CD45+CD34-PE和CD133-PerCP的同型对照抗体
3.补偿调整管：需要3管，一管是CD34-PE+细胞+另外两种抗体的同型对照抗体，以此类推2 a6 i7 Z% F& M# d+ ^" w7 @) C$ l
4.根据检测情况调补偿，调至合理范围。通道之间无荧光干扰。
5.检测样品管，并分析.

作者: nailute1985 时间: 2015-6-9 16:21

回复 SKC-SFC 的帖子9 p4 x6 ~9 M& C5 N3 l# v! F

是这的没错

作者: nailute1985 时间: 2015-6-9 16:21

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十字门不需要的～你这个是逻辑门，例如：只要把阳性管中FL1的名字改成isotype就行了

作者: SKC-SFC 时间: 2015-7-3 09:55

回复 nailute1985 的帖子) d5 x; D% a" f3 V
[8 M, u( B+ Z+ l' b
您好，最近我们又做了造血干细胞的鉴定实验。有几个问题我需要咨询。" c- g- d8 ~; n! H( p# u
1.在检测同型对照的时候，是需要先划门吧？这个门怎么划？
2.在调补偿的时候，为什么3和4通道的荧光没有干扰，不需要调整呢？而1和4通道反而需要做出调整呢？* @# ^4 K$ a9 e I+ _( o( }
3.我看文献上说，逻辑门R4显示出来后，还需要去除比淋巴细胞还小的那一群。但看不出来这个是怎么划新的R4门的？

作者: SKC-SFC 时间: 2015-7-3 10:00

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R4门比较宽，说是需要进一步去比淋巴细胞还要小的那部分细胞或杂质。大概方法是从SSC/CD45的散点图中选取淋巴细胞那群，然后设为R5，然后重新简历FSC/SSC散点图，把R4门复制到此图中，并显示R5，说门划到SSC最低和FSC在100的位置，这个200是左边起还是右边止呢？但得到的结果15%以上，这样的结果不对啊。另外有个样本的同型对照荧光比检测荧光还要强.
多谢回答！

作者: nailute1985 时间: 2015-7-3 16:55

回复 SKC-SFC 的帖子# p2 N7 e) T M9 N

1、同型对照的门当然跟你cd34门是一样的要不怎么叫做同性对照- E1 n% o6 p* V/ p# K% P6 {$ o
2、这个需要看你用的是什么荧光材料了……1、2、3、4四个通道的发散光谱是不一样的。3和4差的比较多那肯定就不需要补偿啊，1跟4差的少，光谱有重叠，那就需要补偿。

作者: SKC-SFC 时间: 2015-7-4 08:23

回复 nailute1985 的帖子; E0 |' A D2 Q+ V1 ^) h

1.CD34的门？不是从FSC/SSC散点图画门后检测3个补偿管（3个抗体）进行调补偿吗？5 {: d; U1 ^0 \- ^
2.然后这个画门的位置在哪里呢？

作者: SKC-SFC 时间: 2015-7-4 08:39

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作者: SKC-SFC 时间: 2015-7-4 08:42

回复 nailute1985 的帖子% N" k# A4 R( v+ G9 h* f

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作者: nailute1985 时间: 2015-7-4 10:25

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1、我的意思是在你做同型对照或者cd34+检测之前就得用阴性对照把补偿什么的调好了，然后你的isotype跟你的cd34+用的是同一个protocol 就不需要单独调了
2、看你设的这些门没有啥大问题啊你是哪个门不确定？$ d( F! ?6 L: j! G

作者: nailute1985 时间: 2015-7-4 10:27

最后cd34+ 0.8%正常啊

作者: SKC-SFC 时间: 2015-7-5 09:26

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都用同型对照了，还有什么阴性对照呢？难不成还得用细胞做阴性对照，不是多此一举吗？

作者: SKC-SFC 时间: 2015-7-5 09:29

回复 nailute1985 的帖子# D9 Y/ g: M5 b9 T, M* q! T5 X T. {
& Z5 l! f# q. h
我们是用调整过的R4（在FSC/SSC的散点图中，显示R5，把R4的图复制过来后，把门的左侧划到200位置）作为最终的结果，大概0.2%左右。

作者: SKC-SFC 时间: 2015-7-5 09:32

回复 nailute1985 的帖子& B/ h3 D! m# Z. u. y4 r, f" Y

大部分门的设置没有太大的问题，有两处有疑惑，第一个在调补偿的时候，同型对照也就是阴性对照的管的划门位置（R1）怎么划合适。第二个是调整后的R4的调整位置在哪里？

作者: SKC-SFC 时间: 2015-7-5 09:34

回复 nailute1985 的帖子: o* U0 s8 a7 `2 I2 }6 `% b

我们此次是检测CD34+CD45+CD133，所以我们按三色的检测标准。2 m: z3 `- E6 i- f2 K' G+ \9 q+ Q8 v0 |
1.FITC+PerCP+APC的三个同型对照抗体加细胞
2.FITC+PerCP+APC的补偿管，共3管6 q+ z; `& p5 a3 w
3.待测管+FITC+PerCP+APC三种抗体2 Y& I3 ^* u" R$ }
共5管

作者: nailute1985 时间: 2015-7-5 12:20

回复 SKC-SFC 的帖子9 _- }. \4 t3 J6 B& E% X

晕阴性对照不是让你调补偿的么，同型对照不是做实验的isotype么

作者: nailute1985 时间: 2015-7-5 12:22

回复 SKC-SFC 的帖子! z9 @8 N" t: ]$ T( j9 `( x

5管没错啊

作者: nailute1985 时间: 2015-7-5 12:23

回复 SKC-SFC 的帖子- @) r2 p2 D6 L1 x; `/ `0 Y5 G, V$ {
* M( S' F: f) h8 [: g( C' r
0.2％也正常的 cd34+细胞百分率不是很多的

作者: nailute1985 时间: 2015-7-5 12:28

回复 SKC-SFC 的帖子( Z' f( [: q* @+ n" ]& v5 d- w

R1差不多就是你那个位置，可以再往左来点觉得你的碎片比较多0 u& U. `% S: v. R. m- ?1 N
R4我觉得你的ssc选的高了，往下来点可以但是你这个r4分了两个群了明显倒是可以都画进来但是ssc一定不要太高

作者: SKC-SFC 时间: 2015-7-6 12:20

回复 nailute1985 的帖子$ K& E9 t; y* |: U' Z+ K& ]' u

不是吧。调补偿有专门的补偿管。阴性对照跟调补偿毫无关系好吧。一般以前我们是光细胞做阴对只是考虑了细胞的自发荧光，没有考虑细胞与抗体Fc段结婚，所以用同型对照来排除非特异性的干扰。

作者: nailute1985 时间: 2015-7-6 14:28

回复 SKC-SFC 的帖子$ K4 U/ k Q/ c2 D

调补偿的叫做荧光补偿管，说白了就是一个相对于阳性的阴性管罢了，这个是在实验前就的调好了的

作者: SKC-SFC 时间: 2015-7-6 15:11

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这个我明白，我们都是调好的，然后检测待测管，这个没有疑问。但我们的第一管是加了细胞和三种同型对照抗体，这个是作为阴性对照来使用的。用待测管的值减去同型对照的值得到最终的结果.

作者: SKC-SFC 时间: 2015-7-6 16:03

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我们根据您的说话，又重新分析了，发现结果高了差不多一倍。说明样品还是存在问题。我们的造血干细胞的样本里面含采集液，成分很复杂，估计有不少类似碎片东西。下次实验我们想标记前洗涤几次之后再标记，也许拖尾不会那么严重。

作者: nailute1985 时间: 2015-7-6 16:21

回复 SKC-SFC 的帖子7 l; O' e m' a
' N$ U" `1 y5 [5 _ I- i7 B& a: x
你们的样本那么不纯的话结果肯定不准确的。洗涤，裂红这些都需要

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