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标题: 关于T7E1 Assay的一个疑问 [打印本页]

作者: Damon-Salvatore 时间: 2015-6-8 19:46 标题: 关于T7E1 Assay的一个疑问

在网页上看到T7E1 Assay，是用来检测cas9介导的外源基因有没有插入到基因组（动物细胞）相应位置。
具体protocol见 http://www.tools-biotech.com/image/2014/05/27/20140527101154.pdf4 r/ `$ x" F" P- i! a$ g! X

如果筛选的某个细胞克隆是杂合子（一个染色体上插入成功了，另外一个没有），最后结果也会出现两条目的条带，和纯合子一样，即最后还是需要测序确认。
如此一来，直接通过PCR检测岂不是更高效（一个引物在插入的外源基因序列中，另外一个引物在上游或者下游四五百bp处，有条带的话就去测序）？
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还请大家多多指点。

作者: misser217 时间: 2015-6-8 19:52

关注中

作者: hyde 时间: 2015-6-8 22:57

这个方法之前好像都是快速检测KO比较多吧，大片段KI的话还是PCR测序，最后southern，KO是应该不能区分单敲双敲吧，只要退火后两条带组成有gap就会切吧。KI如果两条染色体都是KI了，那不就没有效果了吗？和WT是一样的，两条均一就不会酶切吧+ i3 y. @$ O. Y- A$ c6 ~

作者: Damon-Salvatore 时间: 2015-6-8 23:20

回复 hyde 的帖子1 I- g' i, s* G a+ o7 x, e' t3 {

感觉T7E1 Assay没有办法鉴定KO是单敲还是双敲。但是如果用PCR检测的话，扩增引物在敲除区间外，拿产物测序，一比对就看出来是否敲除了，敲除区间如果是双峰（一个是WT），那就是单敲了。至于KI，用PCR（下游引物放在外源基因上，上游引物放在外源基因上游400bp左右），拿产物测序，也可以比对出是否插入，纯合子还是杂合子。那T7E1 Assay岂不是费时费力结果还不好？

作者: hyde 时间: 2015-6-8 23:31

反正talen cas9 ZFN最初的那几篇讨论技术效率的都是那这个酶切亮度来看效率的吧，是为了最初确定打靶工具效率的，不是为了建立单一细胞系的吧，即针对一个mix状态的检测，不是单克隆阶段的测试方式

作者: hyde 时间: 2015-6-8 23:33

类似于最初收样品PCR看峰图的杂峰比例，不太适合单克隆鉴定时期的鉴定

作者: hyde 时间: 2015-6-8 23:38

KI的时候可以特异加入一个酶切位点，这个比测序要快一点

作者: Damon-Salvatore 时间: 2015-6-8 23:40

回复 hyde 的帖子- R9 c1 s- J2 G7 u

原来如此多谢指点

作者: winstonsee 时间: 2017-6-6 15:25

学习中

作者: niliu730323143 时间: 2017-6-26 08:35

KI确实可以通过PCR检测，T7检测indel比较多。

作者: eley 时间: 2020-3-6 15:06

T7E1主要是快速检测敲除效率，最终验证还是要靠测序和WB

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