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标题: 求助ips复苏的问题 [打印本页]

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-10 20:37 标题: 求助ips复苏的问题

我们现在用的小鼠mef饲养层，复苏is细胞，但是两周了细胞都没有长起来，只有一两个克隆，而且克隆一直没有生长。) T0 Y- r5 j' d
有没有大神试过用饲养层复苏，而不是无饲养层培养液？有什么注意事项或者建议吗？' H& _& Z1 p- u' O1 H; a+ m8 A5 K
非常着急！！

作者: nichifanlema2 时间: 2015-7-11 10:42

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1. 冻存的干细胞状态对于复苏效率有较大影响。. U$ J) r4 S- D: I/ `
2. 37度快速复苏、稀释冻存液和离心过程严格操作，不要吹打过于剧烈。
3. 复苏后为提高效率，可以加入Y27632。- ~* v' J& H j9 F! _
4. 常规培养用可以细胞团块的形式冻存和传代。
5. 克隆生长缓慢或者不生长，可能是饲养层太密了，也可能是培养基已经不支持生长了，可以降低饲养层密度或者每天更换培养基。

作者: watchen198891 时间: 2015-7-11 10:52

楼主可以简单说一下你复苏的方式不？同意楼上的说法，还有其它的方面的问题，细胞冻存的方式，复苏的方式，冻存液的配置，复苏时离心的转速以及复苏时细胞打散的方式，太多方面的问题。还有就是你MEF本身的问题，MEF数量以及状态等。

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-12 16:53

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冻存的细胞状态还是不错的。y27632没有加，下次准备加了试试看。饲养层密度还可以，是天天换液。现在看来有可能是把细胞打散了，请问稀释冻存液加3ml每管可以吗？离心转数和时间请问应该是多少比较好呢？万分感谢

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-12 17:00

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mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-12 17:00

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mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-12 17:00

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mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-12 17:00

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mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-12 17:00

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mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

作者: nichifanlema2 时间: 2015-7-13 12:17

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细胞吹打过度会加重细胞死亡，稀释冻存液时要缓慢滴加，一般4-10倍体积稀释没有问题，但是5倍以上稀释可能没有太大的必要，因为一方面浪费培养基，另一方面离心不太容易。可以1000-1500rpm离心5min，或者200g离心5min。

作者: watchen198891 时间: 2015-7-13 12:18

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我也没有加y27632，细胞可以吹散，但是只能轻微吹打，不能反复吹打，有的时候我基本不吹打，手指弹几下，沉淀飘起来就直接加入培养皿中了。离心的话就800rpm，3min。培养基更换一般第一天观察一下，如果液体变黄或者克隆长出较多则换液。我是这样做的，细胞状态还可以。

作者: wangshumin12311 时间: 2015-7-13 13:36

为嘛一定feeder养，，，

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-13 21:56

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非常感谢您细心的解答！4 A, a# M# Z! R1 @! V3 b
请问除了y27632还有什么可以提高复苏率吗？mef密度问题，一个t25大概多少比较合适呢？

作者: nichifanlema2 时间: 2015-7-14 08:56

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常用的就是Y27632,。关于feeder密度，T25培养瓶可以复苏50-80万feeder。

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-14 17:27

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谢谢。feeder的话，是不是一般一周就要更换新的，请问你一般复苏后多久就传代了呢

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-14 17:27

回复 wangshumin12311 的帖子

比较省钱，嘿嘿

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-14 17:28

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非常感谢

作者: watchen198891 时间: 2015-7-15 09:20

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MEF更换是什么意思？是说你铺好没有用可以放多久吗？还是你准备传代的时间？iPS传代时间一般跟你克隆大小确定，当然如果养得比较好的话基本两天就会传代。

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-15 15:29

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我的意思是mef最多可以支持ips生长多久呢？好像听说最多不能超过一周是吗？

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-15 15:33

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还有请问你的冻存液配方是什么呢

作者: 冬天的雪糕 时间: 2015-7-15 16:03

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我还想请问一下，y27632是用ddh2O溶解吗？浓度多少呢？还有就是10ml培养基的话加入多少y27632比较合适呢？谢谢

作者: watchen198891 时间: 2015-7-15 16:25

回复冬天的雪糕的帖子' E9 m H) u% q% ~0 m! D# m: [- y
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这个到不是很清楚，一般来说ips克隆足够大了就直接传代或者冻存，至于MEF能够支撑多久我没有注意，ips克隆到一定程度很容易出现分化。我觉得MEF不能够长期支持ips生长，要是你的ips长时间不能够形成克隆状态，那你的细胞应该要检查一下。

作者: watchen198891 时间: 2015-7-15 16:26

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血清加10%的DMSO或者培养基加30%血清再加10%DMSO。我这样用的，效果还行。血清太贵，后面就改用培养基来代替。复苏的时候没有多大的问题。

作者: nichifanlema2 时间: 2015-7-15 18:17

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用DMSO溶解，配成母液，用的时候加入培养基中，终浓度为10uM即可。

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