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标题:
CIK细胞鲎试验（内毒素）检测
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作者:
fsj1987
时间:
2015-7-17 16:59
标题:
CIK细胞鲎试验（内毒素）检测
大家hi起来讨论一下鲎试验吧！自己提高也能服务新人
作者:
fsj1987
时间:
2015-7-17 17:00
我先来踩点
* @( d2 N6 G- b3 Y) X% s( A# v
1、实验室物品准的准备
5 N8 T( ?- O# c- X
1.1 涡旋混匀器。
; U) G$ h5 H/ y
1.2 恒温水浴锅。
8 t, f7 u [0 c- _; d5 ^* U' Z
1.3 鲎试剂（TAL）。
+ @# U' K& y5 g8 h+ X
1.4 细菌内毒素工作品（CSE）。
% c3 i: h# W- k9 R3 Q% r# r2 E
1.5 细菌内毒素检查用水（BET），内毒素含量<0.015EU/ml。
0 S) F9 X" l G1 L9 W" F
1.6 无热原试管。
( Y, i6 @5 g% P: e& _( P
1.7 无热原吸头（200ul，1000ul）。
0 ]# N9 w6 d0 g _' C2 `
2、内毒素标准工作品溶液的配置
0 {- }. ~7 g8 n g
2.1内毒素标准品溶液的配置
5 t2 E- A8 G. t( J* u3 T
取细菌内毒素标准品1支，用酒精棉球消毒瓶颈，开启加检查用水1.0ml并混合15min备用。
5 R5 r: C: P# p3 T& z0 x
内毒素标准品为10EU/支，鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml时，内毒素阳性对照稀释至2λ，即0.25EU/ml。（注：横线上方表示取浓内毒素溶液的量，横线下方表示加检查用水的量。）
/ k, \ a' X6 B( L! a9 T
10EU/ml 1.0EU/ml 0.50EU/ml 0.25EU/ml
, H3 ]5 q0 l! R( {1 _6 ~
2.2 供试品溶液的制备
! | l, f9 \8 ^5 k8 e' H- I: e" D; U
有效稀释倍数（MVD），按下公式计算：
$ [3 F3 T7 R e- X
MVD=cl/λ
' @8 V& V4 C H( B9 U) E+ X
式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml；λ为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）。
0 N/ z' Q+ a; o4 x' }" V9 z( p- }9 h
如，细胞悬液其内毒素限值为2.0EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml。
3 J7 P) X- K& {/ W
MVD=cL/λ=1×2.0/0.125=16（倍）
* ^1 n0 E5 o6 _2 @- ~% z- a& }9 }
取供试品0.125ml加检查用水1.875ml，混合均匀做内毒素检查用。
) Q$ x4 b/ N3 s- l+ ^6 e5 @2 h
2.3 供试品阳性对照液的制备
0 N' n( V4 z* r2 C R
分别取供试品的8倍稀释液0.5ml和0.50EU/ml的内毒素溶液0.5ml，混合均匀供检查用。
5 ]$ u+ t8 R5 v6 e' l' [% Z
2.4 鲎试剂的准备
6 A* X: M8 w8 E! h" {9 @9 x
根据供试品的数量，取鲎试剂0.1ml/支若干，按标示量加入检查用水复溶备用。
4 z& M2 l7 B. Q0 \, A4 ~# s
试验加样见下表1。
5 Y. w7 U; {3 k& X/ b* ~* N
表1供试品内毒素检查加样方法
3 R7 a2 P7 P) r8 i: j$ y
- |& J& p& e1 ^2 R" N
. ?, A' Z+ J# d, \2 @- q% t6 H, ~
测试组（A） 阴性对照 供阳组（B） 阳性对照
, \% Q$ ?# P/ Q+ z
1号，2号，3号…n 1号，2号，3号…n 1号，2号，3号…n 1号,2号
% U9 m+ l) U: B* N
鲎试剂溶液 0.1 0.1 0.1 0.1
$ c$ q/ ~$ j8 k% Z
标本液 0.1
# t/ i/ c' ~- Q. q/ [
检查用水 0.1
. `! H+ N, o% d8 i1 b, t. O1 S% k" C
供阳性液 0.1
( I: A: U" M' Z1 `
阳性对照液 0.1
" m) V% X2 d- [+ y! y
2.5 检测
+ A( q0 C% I1 o0 e
加样完毕，将试管中溶液轻轻混匀后，转移至试管内，用封口膜密封管口，垂直放入37℃恒温水浴锅中，保温（60±2）min观察结果。
. L0 }& K C. E, a" }, I- J
判读，时间截止将试管从恒温箱中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成的凝胶不坚实，变形并从管壁滑脱者为阴性（结果判读，当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性，且阴性对照都为阴性时，实验方有效）。
% n: a* a3 ] ~3 ~' M
作者:
fsj1987
时间:
2015-7-18 09:18
今天做的内毒素阳性滑落，然后第二次做就没事，不知什么原因？你们都遇到过吗？
作者:
teahouse0802
时间:
2015-7-18 10:13
我们在实际的细胞培养过程中也会出现假阳性的情况，一般出现假阳性之后都会做平行复检。我们的内毒素检测鲎试剂是不加检测用水的，直接向鲎试剂管中加入200微升待检样品，这可能和选用的鲎试剂品牌不同有关系。
+ O6 r. a: Q% c
4根管两根原来浓度，两根稀释8倍的，如果复检结果为4根管都为阴性，则判定之前的结果是假阳性。
/ d0 q+ X7 {9 ^! Z) H
如果复检结果未稀释的出现阳性，稀释8倍的表现阴性，而我们的内毒素限值是1.0，而鲎试剂的灵敏度为0.125，所以也判定为阴性。
- T" v( b9 S- h
如果4根复检管都是阳性则，则表示这份细胞不合格。
作者:
teahouse0802
时间:
2015-7-18 10:15
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teahouse0802
的帖子
+ `6 A' S! a* D7 U5 I4 }
) o, e9 C& ^# B) N, I% c+ Q
补充一下，同种浓度出现相同的检测结果才算做有效。
作者:
colins
时间:
2015-7-20 14:39
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fsj1987
的帖子
& t- j4 q. L* x9 @( i
* r! I( [8 t1 K- g
如果只是阳性管滑落的话，应该是你操作的时候动作幅度太大了，如果是干扰组滑落的话就应该检查你的干扰试验是不是做的合格。我偶尔碰到一些该凝胶的未凝的情况，结果复检都没事了，如果经常碰到的话就应该加强一下操作了。
$ ~: T3 K! |' X
我觉得细胞类产品很难出现内毒素不合格，所以应该加强操作的熟练程度，我们把内毒素限值定在了0.5，很久都没见到阳性了
作者:
yingfeixiang
时间:
2015-7-21 15:48
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fsj1987
的帖子
1 y. y2 x( [; Y) p
' A R4 _; F( R. @- I
是凝固状态后滑落的话，就是拿起看的时候剧烈碰撞了，我就又一次
作者:
baby00000003
时间:
2015-8-4 10:00
有些个可以不通过凝胶滑落测量内毒素限度的机器
0 H9 F' H5 e5 ^& W# J& O6 ?
通过凝胶吸光度绘制标准曲线的方法定量测量
作者:
免疫与细胞
时间:
2015-8-4 10:12
我们说待检样品，这个是不是太过宽泛了。对细胞培养来说，何时取样、取样样本类型、处理办法（比如需不需要离心）、内毒素检测阳性指标（100ml产品来说，其内毒素含量是低于1EU还是有其他标准），不知大家有什么看法。
作者:
细胞海洋
时间:
2015-8-9 15:54
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免疫与细胞
的帖子
$ v4 m" w/ G2 c* t3 W) J, j* `
* a2 Y1 Q2 w) t6 C3 }
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