干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 细胞培养注意事项 [打印本页]

作者: CART 时间: 2015-8-9 16:33 标题: 细胞培养注意事项

【自己总结的各家经验汇总】

细胞培养注意事项

1.实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70 %ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2 _+ R4 l0 t2 _* r0 s! g1 X
2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。" r+ n: d. Z8 z* Z6 R$ {

3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45%26deg;角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。2 U3 c, G8 {5 K
1 K6 Y! N- H; ]8 N2 }. L8 \" n  B$ X
4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。, q0 R+ f3 k$ H8 K0 Z6 p% R  O6 f
" d: S" F/ P% E  ~* a3 I1 o
5.定期检测下列项目：
(1)CO2 钢瓶之CO2压力。
(2)CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
(3)无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。
; c( d5 ~7 Z# C  `& b* p; c) F
6.水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。5 L7 @8 f0 X% O3 \/ R

7.关于工作浓度的胰酶是不是应保存在－20度？如果放在4度冰箱可以保存多久？是不是几个小时就会失去活性？
平时放在-20度，分装在50毫升螺口管，用时拿一管放4度用。 ' p, ]4 w  d! U* }% o' v
+ j; V3 Z/ Z, {4 y) ?! j& i
8.认真按照操作规程进行实验，一般不大会导致污染，很多情况下是由于所用的试剂或培养基有污染而使实验失败， % G' [% H9 x. B$ I$ c0 X

9.粉末培养基配制好后(加了血清)，一般在4度尽量不要超过1个月，如在-20度存放时间可长一些，但最好也不要超过3-4个月，可能对于永生化细胞株来说要求不是太高，但我在过去的4年里一直是作原代细胞培养的，细胞娇弱，经验表明放置时间不宜过长。

10.关于实验用品的清洗与消毒，我的经验是：用过的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上，然后加少许清洗剂，以超声波洗涤30min左右，(如无超声波洗涤器可用软毛刷轻轻刷洗干净)，捞出晾干，再在铬酸洗液中浸泡6-18h(或过夜)后，自来水清洗10-15遍，双蒸水清洗3-4遍，晾干，高压消毒后即可使用。

许多塑料制品也可以高压消毒，例如培养瓶盖，胶塞，吸头等。不能用于高压的一般均已制成一次性作用的商品了，当然如果money有限，如进口的培养板、皿等，也可以重复使用1-2次，我当时使用方法是将其完全清洁后，使用前在紫外灯下敞开照射1-1.5h即可，我做过多次，没有出现问题。塑料培养瓶由于清洗消毒不便，最好不要重复使用，如一定要重复用，可用环氧乙烷等消毒，(消毒后一定要放置半年以上方可使用) 。, u1 v$ m! h* C9 f" M9 K" E; `* F
4 o7 A# M, L! P, x+ p& `5 t) }
在光镜下，上皮细胞通常呈%26ldquo;铺路石%26rdquo;样排布，细胞之间有拉丝现象(即距离较远的细胞可以通过细长的触手相连)，细胞有成片生长的特性。而间质细胞通常呈梭形，没有有成片生长的特性，细胞之间的联系不紧密。但是细胞的形态特征会因为生长条件的改变而改变，如HeLa细胞是上皮细胞，但是在酸性培养条件下会变为梭形。
$ N5 r$ K1 e3 r! ?
上皮细胞之间都有特征性的紧密连接(桥粒)结构，因此可以通过观察培养细胞的超微结构来判断细胞的类型，如果有紧密连接，就必然是上皮细胞。这是一锤定音的证据。注意不要把细胞消化下来做电镜，要用细胞刮刮下来后做电镜。此外每一种上皮细胞都有其特征的细胞角蛋白的表达(cytokertin，CK)，可以查一下子宫内膜腺上皮细胞表达的CK分子，然后进行免疫细胞化学的鉴定。
, [5 @* p: H/ `5 S( {1 C4 k
细胞在偏碱的情况下培养，耐受能力会逐渐下降，可能是产生脱壁现象的原因，后来我重新测了一下培养基，为7.5左右，我用灭菌的HCL调了一下，培养基颜色变成淡红透亮，再次培养，发现细胞贴壁比较好了，搏动效果也不错，因此，我以后每次培养前都要重新调好PH值，我觉得很多因素是能影响PH值的。8 v" O8 T0 Y# ?! C+ p& i1 b

血清质量不好，影响了细胞生长。所以，我认为以后养细胞，用的血清浓度最好是每批次血清都摸一下，不一定要以参考文献为准，毕竟国产的血清质量差异比较大啊。

细胞无菌操作是关键，对于配制培养液时，有些人为了让培养粉充分溶解，搅拌4小时或更长时间。其实这完全没有必要，一般培养基的固体组分还是易溶于水的，搅拌的时间长了会增加污染机会，虽然后来滤过除菌了，但细菌的代谢产物比如脂多糖谁能够把它滤掉？细菌的代谢是很快的，甚至在常温下20min就可以繁殖一代，太可怕了。我的经验就是搅拌30min-60min就把它过滤。

另外关于培养基的pH问题，一般按照说明书操作，加入所说的NaHCO3量，与预计的pH不会有什么距离，也就是说基本上不用调pH，如果相差大，要考虑三蒸水的质量是否有所下降，当然这时调pH也是不得已而为之。我配培养基时基本上不调pH，只是用试纸检测一下pH，观察一下培养基的颜色。

11.东西一定要用自己的。既不要借别人的，也不要借给别人。可能大家觉得比较自私。实际上还是很有好处的。并不是每个人的操作都规范，因此相互之间串着用，很容易造成交污染。
$ \$ U; S! R. d1 l6 \
12.我习惯口对口倒液体，在倒前倒后都要在酒精灯上过一下。自己认为比起用吸管吸更能很好的防止污染。步骤越简单，越能防止污染。而且还能节省很多吸管。

13.一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要做到半路，又出工作间拿东西，这样增加了污染的机会。
2 ^! s  G8 x! G/ W7 b6 C( [
14.整个操作要快、动作要轻、而且不要干其他的事情。比如手机响了，最好不要接。我一般操作的时候将手机关了，手机声音响起，好烦躁。

15.我一般开紫外线照射台的时候，就将培养基、酶、DHANKS液那到室外让它自然升温。这样40分钟后，温度也升上来了。有很多人将他放到37度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生，有的常年不清洗，里面很脏，容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水浴锅拿出后，最好找个毛巾擦干上面的水。   ^# b* \- o! ?+ v
- L0 @- V) u9 Z0 L# w" g0 s
16.操作前要洗手，用75%酒精擦手。用完操作台，要打扫卫生。
7 T: y# T% ^: ]% }& U2 D0 X+ n8 t% {
17.细胞要经常冻存，我一般只要细胞状态好就将细胞冻存起来。细胞状态差了，扔掉，重新复苏。这是一个必须养成的习惯。毕竟很多情况下，细胞并不是因为污染了，才让你感到头痛。这样你不会担心没有种子了。我一般是不加双抗的，只要注意，不会污染。 : f- _! y( r; c5 Y1 g% }  E
" g7 W! i3 _1 W: z) V
18.过滤时不要用枪吹细胞!!! 如果用力吹，筛网就像刀片一样，把你的细胞全部切碎!! ) s% J, U/ p! w# T+ N' P# W% b' n

19.刷玻璃器皿的过程：初洗、泡酸(一天)、自来水冲洗(10遍)、纯化水冲洗(3遍)、注射用水冲洗(3遍)。感觉过于苛刻，自来水只冲洗3遍。被老师发现后，一阵痛批，才知道这是极其关键的一步，残留的酸可能会抑制细胞生长，甚至导致细胞死亡，痛失辛苦得来的细胞，心血付之东流。无知不能无畏，一定不能大意。
$ J8 ]' ^! A' r- I" f
20.做好准备工作。不要急于投身到细胞培养中去，要先设定计划：步骤，工具，试剂。特别是将细胞用于大规模生产时，尤其如此。eg.经过干热灭菌的容器一般认为可以在一周内保持无菌状态，如果准备多了，用不完的就得重新灭菌，耗费能源、占用灭菌空间，不值得；干热灭菌需要一天的时间，当器皿准备不足时，只能干着急，错过了最佳操作时间，也许得很久才能将细胞状态再调整好。

21.对于娇气的细胞，我一般都是第一天处理完后，加少量培基(够盖住瓶底部)，第二天换液，以免死细胞和碎片对活的产生不良影响。新配的培养基直接用很清亮，但是在－20度保存一段时间后再溶解就要出现很多杂质，用37度水孵育没有效果，握在手里不停摇动非常有效。其实对于操作熟练的人来说，污染并不是我们想像那样容易出现，园子里很多人都问否污问题，而培养基的PH值往往被忽略，而且大多数人都习惯于一次配制1升培养基，分装成10X100ml，用1瓶，另外9瓶放在－20度保存，很容易出现结晶，镜下看就是一些杆状的物资，有时候晃动培养基，肉眼就可以看到很多沉淀，这就需要我们在用之前好好摇匀了。
) k; `1 @% Z/ Z% Q" t4 B: R2 a
22.细胞冻存：当细胞状态好，或者代数比较早，一定要大量冻存，不要吝惜暂时的大批使用血清，当细胞状态不好，长不起来的时候，马上取出来复苏，省时省力，不要去尝试努力恢复状态不好的细胞，费时间也费血清，会令你痛苦不堪。另外冻存的细胞不要放到一个地方，－80度，液氮(甚至不同的液氮罐)都放一点，谁也不敢保证不出意外，冰箱也可能有化的时候(我们－20度冰箱就化过)，都放在一块容易全军覆没。

23.按照试剂的保存标准保存，象血清、胰酶等没开封的-20℃，开封后-4℃保存一般不超过7天(用完它吧，不然浪费了) 。

24.一定要弄清楚每个组分的作用、特点，比如NaHCO3容易分解，因此培养基在过滤除菌时pH会上升，一般是0.1-0.3，所以在过滤之前，要把培养基的pH调低0.1-0.3。如果你不了解NaHCO3容易分解的特点，就不会做相应的处理，那么培养基不符和要求，细胞就长不好。台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时，细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可，活细胞不被染色。方便易用，因此在实验室中比较常用，尤其在心肌细胞原代培养中。

除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。: k5 N: {$ s/ a1 h, ~4 ~* R" o

作者: CART 时间: 2015-8-9 16:34

求积分啊！

* ]$ I N. D6 \3 |

作者: 67879063 时间: 2015-8-9 20:40

作者: peng1281090563 时间: 2015-8-11 14:58

谢谢分享

作者: 春玲子 时间: 2016-4-1 13:59

回复 CART 的帖子

作者: 小沙弥敲木鱼 时间: 2016-4-3 16:34

作者: 春玲子 时间: 2016-4-22 11:06

回复 CART 的帖子
' [6 `+ d- X: L; i' u8 O, z% ~) w6 g
你可以分享有用的资料，或者多多参与讨论，在互相学习中获得积分

作者: shuimiao327 时间: 2016-5-12 09:52

手机、手表等个人物品是禁止带进洁净区的。我们是禁止口对口倒液的。

作者: 老姜 时间: 2016-6-4 09:06

用心的积累与大家分享！谢谢！; Y& V9 e/ h; Z3 }
细胞培养试剂或培养悬浮的细胞是避免口对口倒液的，瓶口及瓶口处细菌和浮游粒子最早侵袭的门户，另外，倒液有时会在瓶口外侧出现回流，这会增加污染的概率。尤其是新手上路，建议有鉴别的分享哦！

作者: 我的小宝贝 时间: 2016-6-6 11:32

我们用的吸管全部是一次性的，避免交叉污染，口对口倒液体，是禁止的。感谢楼主这么用心的和大家分享这些经验，处理细胞的过程中，只要是手离开过超净台，再放进超净台就要喷酒精消毒。

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)