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标题: 免疫细胞培养内毒素检测取样及合格标准 [打印本页]
作者: 免疫与细胞    时间: 2015-8-12 09:16     标题: 免疫细胞培养内毒素检测取样及合格标准

我们说在内毒素检测时的待检样品，这个说法是不是太过宽泛了。对细胞生产过程内毒素检测来说，何时取样、取样样本类型（细胞液，生理盐水悬浮液）、处理办法（比如需不需要离心）、内毒素检测阳性指标（100ml产品来说，其内毒素含量是低于1EU还是有其他标准），不知大家有什么看法。
作者: colins    时间: 2015-8-12 10:19

在《中国药典》上规定对于待检样品要做干扰试验，对于样本类型的问题，可以做个干扰试验看看，如果细胞液没有干扰的话可以选择细胞液作为样本类型的，有干扰的话就要另作考虑生理盐水是否合适；至于内毒素检测阳性指标，这个是有公式计算的，不过需要注意的是，取值的时候一般要比计算值严格2-3倍，比如计算出来是1.5EU/mL，而我们实际操作的时候会取0.5EU/mL。对于何时取样的问题，我们一般是在冻存和细胞回输之前取样，从我们的经验来看，内毒素的超标比例还是很小很小的，没必要在培养过程中就取样，有点浪费幺
作者: cheeray    时间: 2015-8-12 11:00

回输前两天进行取样检验就可以了。，检测过程也是需要时间来观察。检查后的收集也要注意无菌操作。不能松懈。要对病人负责。
作者: 元杰5    时间: 2015-8-12 11:24

针对楼主说的，在生产过程中取样检测没有必要也不准确，因为如果培养过程中没有大量染菌（而且是G-菌）那么细菌内毒素就不会超标，需要做好的是1.物料的检测，确保
作者: 元杰5    时间: 2015-8-12 11:37

元杰5 发表于 2015-8-12 11:24 " L# c3 }8 o6 P9 d
针对楼主说的，在生产过程中取样检测没有必要也不准确，因为如果培养过程中没有大量染菌（而且是G-菌）那么 ...

0 F& N$ p0 }) P" m0 I0 _……发错重发……针对楼主说的，在生产过程中取样检测没有必要也不准确，因为如果培养过程中没有大量染菌（而且是G-菌）那么细菌内毒素就不会超标，需要做好的是：
/ I( V9 p) w1 Z: F: x9 Q1.物料的检测，确保不被所用物料污染（很多国产的质量较差的物料都会有内毒素超标的情况）；7 v" l& L- H! G0 L. q% @& W
2.回输前进行检测，这是硬性要求，回输到人体之前必须确认内毒素浓度在正常范围内。但要注意的是，检测的样品要与回输用的样品完全一致，否则检测出来的结果也不具可信度
作者: 免疫与细胞    时间: 2015-8-12 13:45

本帖最后由 免疫与细胞 于 2015-8-12 13:46 编辑 # N+ t9 O0 T% u9 E) K9 _

0 r7 N4 t+ ^  ?0 o/ `; k6 ?& l回复 colins 的帖子
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- |; y8 F  q5 A, t谢谢，学习了。另外请教一下，在细胞回输之前取样，是最终产品制备完成后，从最终产品中取（0.9％生理盐水重悬的细胞液）样吗？如果是，样本中存在一定浓度的细胞，样本是否需要离心取上清进行内毒素检测？不知有没有此类经验
作者: colins    时间: 2015-8-12 14:22

可以在最后一步离心的时候取一些上清液做内毒素检测的；如果你样品多可以像你说的从最终产品里面取（0.9％生理盐水重悬的细胞液）样，我以前做的有细胞也没事啊，先做个干扰试验确定一下，应该没事
作者: colins    时间: 2015-8-12 14:26

回复 元杰5 的帖子0 o' n% h; C4 _% \, t9 a3 ?
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如果回输的样品做内毒素检测有干扰怎么办啊？
作者: 元杰5    时间: 2015-8-12 15:39

回复 colins 的帖子
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) d: s. k" H# C. t. M' \' m( f2 ?6 r初期必须要做干扰实验，这个你前面提过了，一种样品类型做一次干扰实验就够了。“一种样品类型”指的是，比如说同一种生理盐水重悬的细胞液，细胞浓度一致的就是一样的
作者: 免疫与细胞    时间: 2015-8-13 09:17

回复 colins 的帖子* l- Q  v1 H# }. J
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非常感谢，你是说在细胞最后一次离心清洗时取生理盐水上清作为检测样，那这个检测结果与最终产品的实际内毒素指标存在何种对照关系。也就是说，如果检测生理盐水上清，0.5EU呈阴性，那最终产品的内毒素指标是不是也在0.5EU以下，并且小于检测的生理盐水上清中的内毒素指标。（生理盐水离心清洗会不会降低内毒素水平？）
作者: 元杰5    时间: 2015-8-13 11:50

回复 免疫与细胞 的帖子/ u' f& F9 D8 C6 F" w

, t9 _  w! o2 V如果是回输用的，建议还是取最终产品作为检测样，离心洗涤是可以降低内毒素水平的，但洗涤前后没有绝对的对照关系，因为细菌内毒素本质上是一种脂多糖分子（LPS），它在水相中的分布并不是均匀的
作者: 小刘    时间: 2015-8-15 18:41

一般生理盐水是无菌，内毒素达标的，可以忽略不计，因为如果你做实验遇到生理盐水内毒素不合格，那就很麻烦，说明他们厂家的那批大输液都会有问题，不是你实验的问题，而是整个医疗的事故，用过这种生理盐水的病人都会感染，所以，你检测内毒素就在病人回输细胞时检测内毒素最恰当，注意自己的操作和器械的消毒灭菌哦
作者: 免疫与细胞    时间: 2015-8-17 09:28

谢谢，您的意思是取最终细胞悬液做内毒素检测，那请问悬液是否要离心去除细胞后再进行检测吗？还是可以直接检测？您有这方面经验吗
作者: 细胞海洋    时间: 2015-8-17 10:52

回复 免疫与细胞 的帖子. v* U. a& s, O6 h) m; I

# {' T& I9 F* d0 F" w/ T6 @你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样
; w" y1 j' }, b" h8 x
! H; @) B$ A0 @) a" S5 Z) R7 @否则他会看不到
作者: 小刘    时间: 2015-8-17 13:27

不需要去除细胞，就是从细胞悬液里取出100ul做就行，如果让别人检测的话送他们1ml就行，避免他们操作失误没有样本，没法复测.
作者: 免疫与细胞    时间: 2015-8-17 15:40

回复 细胞海洋 的帖子+ r1 P2 O) Q) o! }3 G* ^
5 Z) c, Q, I! o  I$ j, f- `) `5 l* n
好的，谢谢
作者: 免疫与细胞    时间: 2015-8-17 15:43

本帖最后由 免疫与细胞 于 2015-8-17 15:44 编辑
- J3 [" Z- e. y1 m# N! \) V
% e  `* P1 S6 J7 O2 O. A6 q回复 小刘 的帖子
/ B8 G$ N$ Q8 h9 }6 r4 \
6 _1 E0 W) y& N. }( W0 n您有实操经验吧！，我们没这么做过，所以比较担心
作者: colins    时间: 2015-8-17 15:54

回复 元杰5 的帖子
% ]- ]& i3 |+ [1 X
+ X* B2 S8 V8 @有些人回输细胞会加入其他的一些蛋白类的添加剂，按照你的说法，检测的和回输的完全一样的理论，但是加了蛋白以后就有干扰了，这种情况您是怎么处理呢？
作者: colins    时间: 2015-8-17 16:01

回复 免疫与细胞 的帖子
- ]: _1 H$ U% b( L9 e/ I6 e1 O. `3 g
如果生理盐水洗涤降低了样品内毒素水平岂不是更好，如果细胞多的话可以取细胞（生理盐水）悬液，没问题的，我做过，没干扰！此外即使生理盐水上清不能完全表示样品里的内毒素水平，但是也应该近似吧，不会差很多，之前已经说了，我们的标准比实际计算的标准严格3倍呢，我觉得这个在可接受的范围内！如果你的细胞很珍贵，那么采用这种方法可以提高回收率啊
作者: 元杰5    时间: 2015-8-17 16:41

回复 colins 的帖子. ?7 j8 X9 N9 A

7 W8 i1 R7 I6 ~3 h( S, ^  F加了添加剂的话，所谓“终产品”就是加了添加剂后的样品。同样，回答19楼的问题，注射进人体的东西不可马虎，虽然我们会设一个较为严格的标准，在理论上不会有危险，但如果真要达到临床注册的标准的话，必须是终产品取样。
作者: colins    时间: 2015-8-18 11:08

回复 元杰5 的帖子, ~0 v- s! K4 K5 H

7 q; H, e, U0 V8 v如果是这样的话，采用光度测定法是不是会好些呢？还会有干扰等因素的影响吗
作者: 元杰5    时间: 2015-8-18 11:39

回复 colins 的帖子
' V1 U( }+ F5 Z, o: {  g+ H9 c6 O4 J: H1 }% d
嗯，有可能，光度测定法应该是能定量的了……但我还没有做过，不好妄加评论
作者: 我是丁香    时间: 2015-8-20 10:37

含量和活性是两个概念，我们只检测活性。
作者: yinxiaoguang    时间: 2015-8-27 10:07

本人不太重视内毒素的检测，只要不污染，同时控制原材料的内毒素含量，就不需要经常检测，只做抽检。即使培养过程内毒素含量高些，经过最后细胞离心洗3次，也会降低到正常水平。我们研究过，因此，控制最后发放细胞时的洗涤次数是关键。
作者: Sarge    时间: 2015-9-1 11:42

我这做内毒素检测是最终回输的细胞混悬液，如果在其他步骤检测觉得没什么意义，只检最终回输物，而且每份细胞都要检测。选择的是美国ACC的快速内毒素检测试管，只用一小时就能出结果，简单快速。
作者: 免疫与细胞    时间: 2015-9-1 14:39

回复 Sarge 的帖子
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& I- X9 I$ _! _1 B' _细胞混悬液直接做内毒素检测吗？还是要离心去除细胞再做
作者: Sarge    时间: 2015-9-1 15:40

直接取样做，因为回输给病人的就是混悬液。我这细胞混悬液本身就三种成分，生理盐水、细胞、白蛋白，可能单种成分内毒素不超标，就怕三种成分混合在一起内毒素超标。
作者: 小刘    时间: 2015-9-5 10:18

这个问题论坛上都已经回答过了，我再给你详细说一遍，既然有疑惑就要给你解答，首先内毒素检测待检样品，这个说法不广泛，这是是个质控把关的重要控制点，质控把关还包括支原体检测和细菌检测等；检测内毒素一般在细胞培养第13天检测最好，这个控制点是确保整个实验室过程中人为操作和试剂耗材产生的污染可以进行再次评估控制，一般为细胞悬液就行，不需要离心，内毒素检测阳性指标，100ml产品内毒素含量是低于0.5EU的，你的问题已经按个给你回答了，望采纳。
作者: 星辰    时间: 2016-3-23 17:15

最近检测发现内毒素有点偏高，但又没有细菌污染。正在复检，头疼啊



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