干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: CIK贴壁并变成了长梭形 [打印本页]
作者: 乖乖咪咪    时间: 2015-8-14 00:28     标题: CIK贴壁并变成了长梭形

机采外周血分离的时候不分层，血清与分离液混合看不到分界，无细胞层出现，细胞混悬在液体中，只有部分红细胞沉淀。做CIK培养，培养第二天细胞基本都贴壁了，第三天发现贴壁的T细胞多数已变成长梭形，在此之前培养液中加了CD3、IL-2，附图，请有经验的大神帮忙分析下是怎么回事，多谢！
  F- ^0 ~1 U5 J. O& fPS：病人病情是右小细胞肺癌四期，目前已不做其他治疗，采血前血常规指标多项不合格，比如白细胞是13.6·····等等，不知道[attach]71378[/attach][attach]71377[/attach]这是不是导致这个结果的真正原因？跪求大神帮忙！！！！
作者: 乖乖咪咪    时间: 2015-8-14 00:31

本人做CIK细胞4年，第一次出现这样的情况
作者: baby00000003    时间: 2015-8-14 08:23

从离心之后细胞聚集的形状看，有没有可能是离心的时候加速减速过大？
作者: teahouse0802    时间: 2015-8-14 10:32

你培养了4年的细胞，如果和以前的操作没有什么区别的话，那么应该从患者身上找原因，贫血、溶血之类的都有可能。
作者: nkcell    时间: 2015-8-14 12:55

是不是离心的转数过大
作者: 小刘    时间: 2015-8-14 13:01

那应该是病人自体细胞的问题，你可能吸取的杂质细胞太多，导致里面的杂细胞生长较多，如树突状细胞等，如你图所示，你那个是典型的离心参数不对，离心机与离心机之间也有较大的差距，注意校准参数。
作者: 刘艳85    时间: 2015-8-14 13:30

应该是患者本身的血液质量不太好
作者: teahouse0802    时间: 2015-8-15 11:07

回复 小刘 的帖子0 n- [. E% \+ G; ?2 M& [

3 k8 b5 Y$ W- R- H; K他已经做了4年的细胞培养了，相信不会出现离心机参数不对的情况。而且，他也并没有提到使用了新的仪器设备。
作者: 小刘    时间: 2015-8-15 11:17

回复 teahouse0802 的帖子
7 ~) P% T" I4 o# _! a$ M* N+ \! u( ?, x3 v" u0 q
我说的是离心机，就像久保田和thermo 厂家一样 同样是800g 10min 但是离心的效果就不一样，我有这经历，不是做的时间长短，而是工作中有没有细致程度，呵呵
作者: mkhorse    时间: 2015-8-15 16:44

分离之后，有没有用血细胞分析仪计数呢？估计是淋巴细胞所占比例偏低，而单核细胞所占比例比较大的原因吧。所以镜下看的话巨噬细胞和树突细胞的前体细胞比较多。没关系，再养几天看看，应该是没问题的
作者: mkhorse    时间: 2015-8-15 16:45

说不定，会有意想不到的结果呢
作者: teahouse0802    时间: 2015-8-17 15:21

回复 小刘 的帖子
, ^0 B  d  s3 o) j% ]9 D' w: t0 s1 j% W; N$ W. U, t. M
如果参数设置的是转速，由于力矩不同有可能出现离心效果不一样。但你说的参数是离心力800g 10min，离心效果不同是什么原因呢？
作者: bukuro    时间: 2015-8-18 10:11

PBMC培养第二天细胞基本都贴壁了，这很正常嘛。您为什么会有疑问呢
1 |5 l/ C9 v) @) v0 Z4 s$ T5 APBMC里的细胞，包括T细胞都是微微贴壁的。平常说T细胞不贴壁，那也不能说是错的。不过，只要您不作弄她，显微镜下看，她还是微贴的，有时她还怕孤单，会抱团。7 k  p" }  u6 E

$ ]8 k7 H, m; O8 z' d/ I2 R第三天发现贴壁的T细胞多数已变成长梭形，您这种说法是错误的。让我怎么说您好呢。不管多厉害的T细胞也不会变成长梭形。除非您产生了误会？
9 u* e3 L6 p. i/ F4 Z, z, [8 A( ~) o; n: g
让我猜猜您为什么会产生误会。; e. T" J3 |7 @
我想您怕是误会了PBMC等于Lymphocyte吧？; T1 o. |# y) }6 H: m" ?. N
其实PBMC是个多元化的东西。复习一下下面这个流式图吧。路人甲的PBMC，您要培养的目的细胞是淋巴细胞吧。她在PBMC里含量很少，少到就那么一小撮。不光路人甲这样，每个人都这样。平常作体检的时候，问问医生就知道啦。; V1 j6 z) T- Y1 [" V4 G
[attach]71439[/attach], }7 S* l5 K+ ^3 I+ z3 z
; P( ]% a# d) m# p# T8 E9 E
刚提取的PBMC,因为您反复的清洗操作，不管是贴壁的单核细胞，还是不贴壁的淋巴细胞，都不会马上贴壁，看起来圆圆的，模样都一样。您是不是以为这些都是淋巴球？那可不是阿。
3 \, r2 `0 ]7 P" b7 e" M3 y  d/ [  @9 F6 M% u" h+ V
看您培养液里加的东西，短时间内不会让淋巴球之外的细胞死亡，长期培养后，大部分就只剩下淋巴细胞了。* i! y' `( a( n' f  B

' K/ `; M( P/ e/ }, t你再多养两天就看出不一样了。单核球和颗粒球会慢慢消失，如果不消失，那就换换培养液吧。4 `; {! X, C7 X& w+ [+ D
2 ^# ]9 W9 h; M0 ]  T! }
另外，我看您提PBMC的图，平常真这么操作吗，是不是太能作了，就不能干净点吗？9 y1 W7 [1 P! N& O7 ^& m( `& l
如果不把实验当成一种艺术，那最少也要求其漂亮。拜托了。7 M; C1 U) S, m" s+ h
作者: momoenn    时间: 2015-8-18 11:12

回复 bukuro 的帖子
% X$ h5 p! H( ?  E, r  b; s: j
3 d6 f4 z8 `+ O我是来膜拜的
作者: 暖羊羊    时间: 2015-8-18 15:31

有没有可能向Ficol淋巴细胞分离液中加液的时候加的太快了，而冲破了界限呢？我感觉这步是个细致活。如果离心机没问题的话，还有一个可能就是病人的个体差异，血液状况不佳。. \; p. }# Q; ~  ?) [/ I$ L3 z  W* X' R
另外单核细胞（DC细胞、巨噬细胞的前体细胞）在CIK的培养体系中生长不占优势，及时带进去一部分杂质应该也不会这么大的比例。
作者: teahouse0802    时间: 2015-8-18 16:00

回复 bukuro 的帖子
( d; @2 i. Y0 q$ o# g; g  P. A# b
  G: B& c: ?: B$ g) B/ w) V赞一个，尤其是后面说的操作要漂亮，做实验就像是做一件艺术品。我刚开始做细胞的时候就觉得带我的组长，手在操作台里就跟能跳舞似的，做出来的东西也特别的清晰漂亮。
作者: cheeray    时间: 2015-8-18 17:09

估计单核细胞比例大。
作者: 鸵鸵    时间: 2015-8-20 16:29

回复 刘艳85 的帖子9 s5 k- r+ D0 b! ]' z
. e  o2 W; [0 x
如何排除患者血液不好这种情况呢？平常也会遇到特殊情况
作者: 鸵鸵    时间: 2015-8-20 16:30

回复 刘艳85 的帖子5 o' g1 T: F+ `# z, c& W7 i" d( x
$ U" x% h/ x& T6 Y( m- M
那怎么排除是患者血液质量不好的情况呢？
作者: 鸵鸵    时间: 2015-8-20 16:31

回复 teahouse0802 的帖子! [- ?6 N/ ]. r# n

) G" d4 e: E" w( M, d% |那怎么样辨别这些情况呢，是否溶血了？
作者: 鸵鸵    时间: 2015-8-20 16:32

teahouse0802 发表于 2015-8-14 10:32 9 f  `8 u4 v; B
你培养了4年的细胞，如果和以前的操作没有什么区别的话，那么应该从患者身上找原因，贫血、溶血之类的都有可 ...
" W; y4 u* Q3 x8 n2 B0 d. P
那怎么排除这种情况呢？有没有溶血怎么判断？
作者: teahouse0802    时间: 2015-8-21 08:31

回复 鸵鸵 的帖子+ v5 P6 @2 `! D8 M) O

6 u( u% M$ e! g# L1.根据患者采血之前的血象检测
! y3 E5 |7 `6 J. C# \2.根据经验判断，血样的颜色、状态等等
作者: wangyi111    时间: 2015-12-10 16:13

不行就换个淋巴液试试
作者: guanjun1314    时间: 2015-12-10 17:04

长梭是树突状细胞吧，个体差异的影响可能性比较大
作者: 乖乖咪咪    时间: 2016-1-7 09:41

回复 baby00000003 的帖子
! ]) j8 [5 x8 M6 s% W  W2 J8 o
8 v  Z4 C3 e# W! H+ }: n  c经您提醒，后来也认真核查了很多遍，发现是使用了其中一台加减速过大的离心机导致了此离心效果。病人再做第二疗程采血后细胞培养的状态依然是贴壁并呈长梭形，依据病人目前情况，分析应该是病人自身问题导致。谢谢您的帮助！
作者: 乖乖咪咪    时间: 2016-1-7 09:43

回复 teahouse0802 的帖子* D8 t5 F: x! [, ~  N! C

; l4 P" q5 Y* t/ b5 ^谢谢！离心效果的问题已得到答案，是使用了加速减速过快的离心机所致。细胞状态系病人自身导致。
作者: 乖乖咪咪    时间: 2016-1-7 09:43

回复 nkcell 的帖子2 e1 ~, w; s5 Y) B( h1 g

2 Y4 G! L& F) l1 A5 ~离心转数2000r/min，是加减速过快了！感谢！！！
作者: 乖乖咪咪    时间: 2016-1-7 09:46

回复 小刘 的帖子! b3 w5 V2 x6 |0 k9 g
; A0 [6 Y0 e6 `
谢谢您！确实是离心机参数的问题，细胞状态应该是病人自身的问题，因为第二次采血培养，换了一台离心机，按相同的流程操作，细胞状态却依旧如此。
作者: 乖乖咪咪    时间: 2016-1-7 09:47

回复 teahouse0802 的帖子
% w6 s( a+ z4 C7 ]+ w  N: i; G9 h. J2 h+ _9 O. `
是其中一台离心机的参数被调过，我没发现使用了才导致这样的离心效果
作者: 乖乖咪咪    时间: 2016-1-7 09:49

回复 小刘 的帖子
4 H! f* T# I2 q0 D  I: X4 P* P8 I7 K
谢谢您认真帮我分析，原因找到，确实是离心机参数的问题，是我没有足够细致认真才导致的
作者: 乖乖咪咪    时间: 2016-1-7 09:51

回复 mkhorse 的帖子
* U7 o! e. z/ _+ h
" C& {  G" u  g/ m实验室没有血细胞分析仪，病人第二次采血培养后细胞的状态也是如此，贴壁并且呈长梭形。所以分析应该是病人的细胞问题。
作者: 小刘    时间: 2016-1-7 11:09

不用客气，做实验就是要细心细致才不会出错，就连两个同型号的离心机都有可能出现离心力大小不均的情况，所以以后操作是注意就是了，这个论坛就是你做实验的坚强后盾，有问题就说，能帮到的都会尽力去做
作者: 御剑红尘    时间: 2016-1-11 09:06

看分离的效果，明显不好，没看到明显测白膜层啊。楼主怎么吸得单个核细胞？至于CIK贴壁，这种现象也是有的，多培养几天看看。细胞状态不大好，多加点自体血浆或白蛋白培养。也可以轻轻吹悬细胞，换瓶培养试试。再有就是病人本身的状态不好，免疫细胞活性变差，也会造成不好养。
作者: roosevelt9999    时间: 2016-1-12 16:37

你可以拿着他的血常规报告跟别人的对比一下，如有白细胞有13.6培养起来问题不大，只是红细胞会偏多而已。这样的现象，主要是他的红细胞压积，浓度等偏低，按之前的离心分离，红细胞离不下去，再一个就是分离液有问题，都可以对比进行操作
作者: zmfang555    时间: 2016-2-24 13:32

这种情况我遇到过多次，是由于患者自身的原因，血常规异常导致细胞密度异常，因为ficoll分离是靠密度梯度的原理进行的，细胞密度异常后通常的离心力500g-800g分离效果较差，含有较多杂细胞，如成纤维细胞还有血小板等，导致后期培养异常。遇到这种情况多次分离也不管用，可以降低离心力，延长离心时间，会好些，也可以采用其他方法如羟乙基淀粉沉降法等。
作者: 清如许231    时间: 2016-2-24 15:15

目测是手采的，白细胞太少，用磁珠钓吧~~
作者: guanjun1314    时间: 2016-2-27 11:54

我也试过发现这种情况，针对这种情况个人认为如果操作规范的话，要从病人的标本考虑，只是个别差异而已



欢迎光临 干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/) Powered by Discuz! X1.5