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标题: 干细胞的复苏与冻存如何操作？ [打印本页]

作者: kate8801 时间: 2015-8-19 15:13 标题: 干细胞的复苏与冻存如何操作？

本帖最后由 kate8801 于 2015-8-19 15:16 编辑 : g' f3 o' W' L, {" {' n! c" Q

（1）准备 37°C 水浴和预热到 37°C的完全培养液；准备好一个15mL离心管，同时加入9mL的完全培养液；% H g- X& j8 b0 u- d3 M
（2）准备好这些后，将细胞从液氮中取出，放入到水浴锅中，同时轻轻摇动，保证细胞能够在2min内完全溶解，同时应该注意不要把冻存管的管口没入水浴中（可能由水引起污染）；: g+ \! I: n) L- S9 _
（3）溶解完全的细胞要快速转移到无菌超净台中，用75％酒精棉球擦外表面。用吸管将冻存管中细胞悬液吸到15mL的含有培养液的离心管中，同时用培养液洗2次冻存管，一起加到离心管中吹匀，避免产生泡沫；
（4）250 g 离心 5 min；弃上清液，加入2-3mL预热的完全培养液，轻轻吹匀，保证细胞完全重悬；
（5）将重悬的细胞接种到T25或者是T75的培养瓶中，加入适量的培养液，再把细胞摇均匀，放入37°C 、5% CO2 培养箱中；# j0 N, n: b! t' k- }
（6）第二天进行换液，保证去除死细胞。正常的培养过程是三天进行一次换液，如果细胞长到有80-90％汇合进行传代。! D- D7 G N9 C$ g2 {1 n6 I
细胞冻存：将冻存管放入冻存盒里，再放入-80℃过夜，由于聚氯乙烯导热比较慢，所以温度可慢慢降下来，次日可直接放入液氮罐。: E% C4 @3 p% }4 O( G* N7 V

作者: 子非鱼 时间: 2015-8-19 17:00

细胞水浴解冻的时候可以在还有一点点冰块的时候就转移到无菌超净台，不需要溶解完全。

作者: 元杰5 时间: 2015-8-19 17:13

请问你复苏的是什么类型的细胞？我们的复苏方法不太一样：准备37°C 水浴，准备4°C预冷的生理盐水或培养基，复苏时注意复苏终点是肉眼可见的小冰块完全溶解的一下。后面洗的步骤基本一致。
至于冻存，-80℃过夜没问题，我们常用的是程序降温仪

作者: hefan1234 时间: 2015-8-20 09:10

步骤2中，冻存液不要完全融化，到即将完全融化为佳；步骤3中，最好先将细胞转移到新离心管中，缓慢滴加培养基来稀释冻存液，防止渗透压骤变损伤细胞。

作者: woshibotao_01 时间: 2015-8-20 13:50

复苏最好在一分钟内融化。
还有想说的一点就是复苏时一定带好防护面具和手套，避免由于冻存管爆炸引起的受伤。

作者: 2014052 时间: 2015-8-20 13:56

冻存细胞，最后都是要放到液氮罐里面的，人家说如果液氮中有支原体的话，那么冻存的细胞也会被支原体污染，请问大家怎么看？盼回复讨论

作者: 细胞海洋 时间: 2015-8-21 00:06

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作者: chuanbaozang 时间: 2015-8-21 08:18

另外，你放在简易程序降温盒里直接放到-80℃进行冷冻，不是因为盒子是聚氯乙烯的缘故，是因为盒子中有有机溶液，比如异丙醇等，可以在降温过程中产生一个缓慢的降温曲线，基本满足降温和冷冻的需要。

作者: colins 时间: 2015-8-21 16:40

现在有不加有机溶剂的盒子，更安全啊

作者: zjhzxp926 时间: 2015-8-29 20:38

冻存的细胞放在程序降温盒里再放入零下80度冰箱就可以了- m- z2 w# x- y3 ~; j: D
复苏的时候要快，注意复苏的时候要戴好防护面罩，防止冻存管爆裂，毕竟安全第一嘛~

作者: Sarge 时间: 2015-8-31 08:37

第一步中，培养基预热到37度，有必要么，觉得细胞刚刚从冰状态下融化，37度的温度有点高吧，个人感觉还是室温或者室温低点的温度就行，让细胞和环境温度一起缓慢变化才对。

作者: 2014052 时间: 2015-9-11 12:45

回答上面的问题，有的实验室认为只要液氮中有了支原体，一罐子细胞都会被支原体污染，但是在本人实验室，没有发生过这种事情，没被污染的，复苏之后照样不被支原体污染，所以，请问能不能告知你们用的哪家的冻存管？以后我等要封杀之！

作者: fangtaoye 时间: 2015-9-25 08:51

用内旋的冻存管，应该可以避免炸管了吧。另外想问一下大家洗DMSO的时候都是多少转速和时间合适，为什么这么设置，不甚感激

作者: 细胞海洋 时间: 2015-9-25 09:34

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作者: 周小木 时间: 2015-10-16 22:27

复苏的温度我们用41度，是为了保证在1min内可以融化冻存液（不是全融），避免DMSO对细胞伤害；避免爆管可以在水浴之前把冻存管的盖子稍稍旋松（不是旋开），颠倒几下，倒出里面的液氮。。。

作者: 小豆芽 时间: 2016-1-12 14:18

细胞复苏时，我们的一般是将冻存的细胞放入37℃水浴中融化，融化至细胞处于半冰半水状态。 d" O+ \4 U+ f' A3 S
冻存细胞时，冻存管放入程序降温盒中，后放入-80℃冰箱，然后再转入液氮中。

作者: yooung 时间: 2016-1-12 16:29

复苏时，感觉37度水浴温度有点低。我试验过从-80冰箱拿出装有1ml细胞悬液的冻存管放入37度水浴箱中到细胞悬液完全融化的时间为一分五十几秒到两分十几秒。由于冻存管的塑料材质有一定的隔热性，在37度水中水浴时，冻存管细胞悬液的实际温度会低于37度。我认为为了缩短融化时间，应该将水浴温度提高3~5度。

作者: yooung 时间: 2016-1-12 16:35

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我们洗DMSO的时候的转速和时间和平常细胞离心的一样，1000rpm,5~7min。我认为洗DMSO时，还是从离心转速和时间对细胞最小伤害方面考虑，而不是怎样的离心转速和时间洗DMSO最干净方面。

作者: yooung 时间: 2016-1-12 16:44

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1.不用液相液氮罐，改用气相液氮罐，冻存的细胞不与液氮接触，就不会被支原体污染。9 z( N9 N7 p5 M0 l" ]: y
2.如果还是用液相液氮罐，可从冻存管密封上面来考虑，例如说，冻存管管口缠上封口膜之类。

作者: liqiang8589 时间: 2016-1-22 15:30

我们实验室在用 Thermo science（life technology）的冻存管，冻存管爆炸还没有发生过。

作者: Diane0321 时间: 2016-1-25 09:02

冻存和复苏的原则是慢冻快融，冻存前的细胞最好一天换一次液吧，而且冻存细胞最好选择对数生长期的细胞，已经长满的细胞冻存后生存率会降低。

作者: haibara007007 时间: 2016-1-26 14:28

回复 kate8801 的帖子, t/ R) P& j3 h% G6 t* i

未全融化就要拿入超净台，现在培养瓶中加入1ml培养基，然后加入融化的细胞悬液，然后缓慢的先加入1ml培养液，摇匀，再加入2ml，摇匀，再加入4ml，摇匀，再加入剩余的培养液，摇匀，虽然繁琐，但是可以让细胞逐渐适应，提高活率。

作者: jenny114402 时间: 2016-1-31 10:25

复苏快，缓慢逐滴加入装有培养基的离心管中，然后洗冻存管，然后轻轻混匀细胞再离心，动作一定要轻，基本就可以了。

作者: 121qwq 时间: 2016-2-2 09:57

初期可以两天进行一次换液，后期换液时间可以延长

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