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标题: 脐带血CIK细胞的详细制备及培养过程 刚开始做希望大家多多帮忙 [打印本页]
作者: 张荣华    时间: 2015-8-24 16:32     标题: 脐带血CIK细胞的详细制备及培养过程 刚开始做希望大家多多帮忙

求教脐带血CIK细胞的详细制备及培养过程
作者: hengton    时间: 2015-8-24 16:50

本帖最后由 hengton 于 2015-8-24 16:52 编辑
5 C  Y& _3 d, u; C5 V3 Y6 j
. |8 G- w/ [/ p$ q9 ^: _
7 k6 I- o9 Y4 z7 J, J! v( ^1. 将分离机采集细胞缓慢加在细胞分离液上，体积比为1:1，800g，室温离心20分钟；, d8 D. e* u( z$ S% D) M
2. 收集界面的白色絮状细胞加入30ml的低糖DMEM培养基，轻轻吹打混匀，300g，室温离心10分钟；& h9 \4 n% C1 N) p9 t
3. 重复离心洗涤共3遍；
# {# K. ]( Y, s- b4. 收取细胞轻轻吹打混匀，加入无血清培养基及IFN-γ 置37℃、5% CO2 孵箱中培养；
) Z' e9 l) i' G- S5 ~- [5. 24 h后加入IL-2 ，CD3 ，IL-1  继续培养，；8 I' }9 ]) Z) s
6. 每天观察细胞生长状态并根据情况进行换液及加入IL-2 进行扩增；$ M2 X6 {# k* u( m; m5 n
7. 细胞收集：第14-20天收集细胞，离心弃上清液，用生理盐水洗涤细胞2 次以上，重新混匀，悬于100～200 ml 输注用生理盐水中。
0 {" a: L- z& Q( \7 V7 @( o: v5 r
作者: zgzy    时间: 2015-8-25 11:16

建议在培养第8天左右及回输病人前做细胞质量检测及活性检测，以确保安全性和细胞活力
作者: cheeray    时间: 2015-8-25 14:14

脐带血 应该跟采集外周血培养差不多吧。。
作者: 张荣华    时间: 2015-8-25 15:15

回复 hengton 的帖子6 g' n' j! c1 y1 S+ Z) F7 r
, r; R+ U# K: F, V: ]
请教CIK细胞刚开始的接种密度是多少比较合适，我养的细胞大概在7天左右细胞就开始出现溶解的状态，细胞膜开始模糊，这是什么原因呢
作者: 张荣华    时间: 2015-8-25 15:17

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, X' u$ a3 o. w/ |2 V4 Q
+ N0 e2 b9 }/ p* x- j不知道是不是差不多，那你们外周血的过程是怎样的？能否让我参考一下
作者: hengton    时间: 2015-8-26 10:34

张荣华 发表于 2015-8-25 15:15
& r& T+ M! F+ `+ c5 s8 ]回复 hengton 的帖子7 @% _; Z& g0 X/ L1 \

7 E! d" l) V. T- \/ O请教CIK细胞刚开始的接种密度是多少比较合适，我养的细胞大概在7天左右细胞就开始出现 ...
, @7 R% ~! c) c* ]
1、密度一般是保存在1.0-2.0*10^6个/ml左右。这样细胞生长比较好。% r2 T! d  u" d; b3 R6 D- B0 Z5 E' [
2、你用的是什么培养基，会不会是NaCl浓度导致的细胞胀破？
作者: 张荣华    时间: 2015-8-26 11:51

回复 hengton 的帖子  a7 i( F* Y( P9 O

, G; `( p/ N& }# y- |2 g我用的是GT-551培养基  
作者: 鸵鸵    时间: 2015-8-27 09:03

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+ s1 t5 P# `! }# O. a2 Y/ t
+ i# D! q6 e& m% J我们用的是1640，接种密度和楼上一样，没有出现过细胞破裂的情况，而且细胞在5-9天是增殖高峰期，建议楼主换一种培养基做下对比实验看看
作者: 张荣华    时间: 2015-8-27 09:09

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7 O$ G* m: y' A0 Y7 z1 j2 s. j) v5 a& _' X3 ~' U
好的，谢谢你！还想请教一下你们吸取白膜层大概能吸取多少毫升？
作者: 张荣华    时间: 2015-8-27 15:32

回复 鸵鸵 的帖子& W# a' ]& T1 t& F- M/ f% V5 X/ _, r# j
% E. O8 s1 E- u1 v1 \; s$ u: f  Q
我们培养的细胞第7天有很多细胞长出角，是别的细胞呢还是啥原因造成
作者: hengton    时间: 2015-8-27 15:47

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& P, ?: j4 |7 a0 i4 [- o  i8 ~. ]$ g. [: L; h- J/ g- w6 P& |
不是帐角，是树突状细胞，也就是DC细胞了。
作者: hengton    时间: 2015-8-27 15:48

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0 T4 `5 t1 E# g- p4 o
6 y' W, k3 o, d" o20-30ml左右，具体还得看淋巴分离液的分离效果好不好。
作者: 张荣华    时间: 2015-8-27 15:52

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: }* d0 \$ D0 Z" N; t  J. Y+ A" B; E! H
还想请教，我们在培养7天的时候出现了细胞角化的问题，有很多都是长角的，是啥意思。
作者: 张荣华    时间: 2015-8-27 15:55

回复 hengton 的帖子5 ?4 i9 _1 z6 E+ N
8 D% t- d, B/ L& ~6 y! k
那我只需要继续养着就可以了吗
作者: 张荣华    时间: 2015-8-27 15:57

回复 hengton 的帖子* l, _  [  k& E2 @

0 m: F1 U- k. j) M5 q我们是20ml的淋巴细胞分离液和20ml的血液。你们是怎样的比例，可以收集到20-30ml( L3 f! D0 C6 H) U8 b' r& C
作者: hengton    时间: 2015-8-27 17:26

回复 张荣华 的帖子* D& O" p4 k. U1 B

% h. r) F* j1 y6 j  D3 h如果是你这个体系的话，大概可以收5-8ml左右。你用的是哪个牌子的？我们用的体系可以2:1，也就是30ml全血加15淋巴分离液。或者是去掉血浆，加生理盐水至30ml然后铺血到15ml分离液上面。
作者: 鸵鸵    时间: 2015-8-28 08:55

回复 张荣华 的帖子; `' v% E/ s- k! R6 L/ o; @6 n

. ]1 g4 Q* L- c, @+ C+ s* E要看情况的，白膜层比较集中的，我们就直接吸取白膜层，大概5-7ml左右，白膜层比较分散的，为了避免浪费细胞，就要多吸点，但离下面的红细胞层至少要有2-3cm的空隙。以防吸入红细胞过多，对后续实验有影响
作者: 鸵鸵    时间: 2015-8-28 08:55

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* s! [0 H) G% W9 O$ Z" S6 @9 ~" h+ `- ]( _; o% y8 y/ [" t/ N1 \  \+ E
要看情况的，白膜层比较集中的，我们就直接吸取白膜层，大概5-7ml左右，白膜层比较分散的，为了避免浪费细胞，就要多吸点，但离下面的红细胞层至少要有2-3cm的空隙。以防吸入红细胞过多，对后续实验有影响
作者: 张荣华    时间: 2015-8-28 09:27

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3 G' s+ c( K* f! O& R
4 j. I5 Z2 Q1 U' d3 ~- U# J' _好的，明白了 。那我们吸的有点多了，我们洗涤后都能看到离心管底部是红红的。我们用的淋巴细胞分离液是自己公司生产的。
作者: 张荣华    时间: 2015-8-28 09:29

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% u: O' L  U' N* `. b. ^8 d( l5 P4 q0 s
请问你那里有没有CIK细胞状态好的图片啊！最近养的都不好，都不只好的细胞是啥样的，最好就是不同时间段的。
作者: chenguangyu    时间: 2015-8-28 10:01

回复 张荣华 的帖子2 n5 f& @, q- [6 K' n+ G0 b
0 l- l4 q6 x2 G. l$ f& \- e
10的6次方每毫升，用的什么抗凝剂？
% I7 D6 J3 a) J
作者: 小刘    时间: 2015-8-28 10:34

脐血DCIK把握两个点就行，一个是第二部密度梯度分离的离心参数，一般20分钟 800g或者900g,根据脐血的粘稠度确定，这个就需要经验了，第二个是接种密度，一般脐血的细胞数量较多，接种量不能太多，一般接种密度根据实际计数情况的一半为宜，只要把握好，脐血的增值数量好的很，还有个小诀窍，脐血培养用好点的培养基，如TAKARA 的H3 营养丰富，适合脐血培养，一般的1640根本不行，望采纳
作者: 张荣华    时间: 2015-8-28 11:00

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0 x2 W5 ?: @% l- K; {3 ]+ p! c8 W6 S0 A9 f8 |( y6 T' h' E. y
还想请教你们血浆的离心速度、时间及温度
作者: 张荣华    时间: 2015-8-28 11:02

回复 chenguangyu 的帖子
2 _: `' F' G8 O5 U1 v: v; x. ~1 \
! _$ k& c$ s% r3 J用的拘橼酸钠
作者: 张荣华    时间: 2015-8-28 11:03

回复 小刘 的帖子& `2 N+ n+ t- q0 }4 H
) S" s4 z! [1 U
我么用的是GT-T551  这个培养基好吗
作者: 张荣华    时间: 2015-8-28 11:07

回复 小刘 的帖子
9 p5 r) r' `6 E' z: o0 M, a
) }( i) c0 v0 e6 f还有就是你说的：一般接种密度根据实际计数情况的一半为宜，是说如果我计数是4x107/ml，那我接种的时候就应该是2x107吗
作者: 小刘    时间: 2015-8-28 12:22

GT-551可以用，这个一般，用它的升级版就是H3了，一般在6x107/ml最好，你说的那数量太低了，脐血不可能那么点
作者: 张荣华    时间: 2015-8-28 13:51

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8 b: |: [. Z: J. c( n& T" G7 u9 F0 S6 Q" u5 r
6x107是接种密度吗
作者: 小刘    时间: 2015-8-28 15:02

6-8都行，你要根据实际的计数量来决定，问题还要看你的种瓶体积，加入75瓶中的培养基的量，工艺不同加的量也是不一样 的哦
作者: 张荣华    时间: 2015-8-28 15:10

回复 小刘 的帖子  e- U" i( d9 B3 P
6 ]/ y0 M5 }3 H2 d, y& w
哦 ！如果是25的瓶你们种的密度是怎样的
作者: 小刘    时间: 2015-8-28 15:15

我们不用25的，那你还是按你们25瓶的规格做吧，计数后按4的密度接种，我说的6-8是75的
作者: 张荣华    时间: 2015-8-28 15:32

回复 小刘 的帖子: W7 @* P6 W' d. B, Y
+ W$ H  y' k7 w
哦 好的 谢谢啦
作者: 张荣华    时间: 2015-8-28 15:34

回复 小刘 的帖子
7 f( F% U. _1 o  b4 d
: A4 A9 r  A' A1 O0 X想问你们有没有cik状态特别好的时候的照片？我们第7天转瓶后第二天出现很多长角的细胞，你知不知道这是什么原因呢
作者: 张荣华    时间: 2015-8-31 17:02

回复 小刘 的帖子
) @7 B& s- h3 P% }
: {$ U+ @' Y! z( m我养的脐带血CIK细胞怎么在7天之后有很多长角的细胞
作者: pengxuleo    时间: 2015-8-31 17:10

回复 张荣华 的帖子/ {( s, d" i- ]- W( H
' T4 f. d: \0 }
那些细胞可能是DC，NK等其他的细胞。毕竟脐带血中含有很多前体细胞，可能发生细胞分化的。
作者: 张荣华    时间: 2015-8-31 17:22

回复 pengxuleo 的帖子
) b$ F5 @" p! Q. B2 `: Q2 t0 [4 o  R
那就是说我诱导CIK不是很成功，很多都是长角了，挺郁闷的
作者: pengxuleo    时间: 2015-9-1 17:47

回复 张荣华 的帖子2 _' Y. j* U, H+ ^1 B- B* V

* u% i# h2 Q6 ]你还是做一下细胞的流式检测比较确定~ 看看到底是什么细胞。
作者: 张荣华    时间: 2015-9-6 14:47

回复 pengxuleo 的帖子& ]. N& _( h& \6 \4 u  G
) t+ v1 o4 l! C) ^. b9 N
流式结果已经出来了。11天双阳性都在30%以上，就是洗白状态不是很好
作者: 张荣华    时间: 2015-9-6 15:14

流式检测CIK表型时，为什么要检测CD16
作者: pengxuleo    时间: 2015-9-8 17:32

回复 张荣华 的帖子
5 Z  k3 x* C2 e6 ?4 k
( B+ I/ W$ c& c7 c0 {# V+ j0 T% w" H2 ICD56和CD16是NK的表面标记物，一般细胞分型检测时都会检测的。
作者: leaderhou    时间: 2015-9-10 09:37

回复 小刘 的帖子) P! w) F) b7 r5 u7 M/ I
$ [4 \1 \8 I, d2 v) w/ f
6*107是一次的接种细胞量吗？6*107/ml的初始接种密度是不是太高了啊，文献上大都在1-2*106的接种密度啊
作者: leaderhou    时间: 2015-9-10 09:42

回复 小刘 的帖子2 W0 ~3 s0 I! E

7 I" r+ R1 B  R8 l* L/ A比如100ml脐血，分离得到了1.2*108的细胞，那么我的接种细胞数就控制在6-8*107就可以了吗，我们用175cm2的瓶子接种，接种密度呢？
作者: leaderhou    时间: 2015-9-10 09:47

回复 小刘 的帖子6 B6 X: g$ p" q& S3 A" p

* ?4 B6 P- u9 y5 ?  R5 h/ o我们养的CIK细胞的增殖倍数都很好，我甚至养过一次14天的增殖倍数到了1000多倍，但是CD3CD56的双阳率一直不高，不知是什么原因呢。我们自己做流式，也曾经送去第三方检验，流式应该没有太大问题，还是培养体系的问题。
作者: 海北    时间: 2015-9-16 08:51

回复 pengxuleo 的帖子% m' B1 U2 b4 Z0 p) i3 _

  X+ O7 e6 T! q, F- j那为什么不只检测CD56，还要再检测一个CD16
作者: 鸵鸵    时间: 2015-9-16 09:58

回复 leaderhou 的帖子3 I' t) q" I# ~, W5 T
1 ?! G. x4 u( E9 T
请教如何提高CIK的cd3cd56的阳性率呢+ P* J! r# r$ I: F. g/ m9 j
http://www.stemcell8.cn/thread-79500-1-1.html
6 b  q  D. A/ l% W. [你可以看一下这个帖子，就是针对你说的这个问题的
作者: 鸵鸵    时间: 2015-9-16 10:07

回复 海北 的帖子
5 v' i9 n! w* O" c
( _2 Z5 T! C8 ~# t) \+ B% n* KCD3-/CD16+CD56+是NK细胞的特异性标志，是要一起检测的
作者: 鸵鸵    时间: 2015-9-16 10:10

回复 leaderhou 的帖子) U1 {$ _# Z! @& ~

* r7 [! k1 r: n. @  y依据我们的培养经验，6*107/ml的初始接种密度是太高了，营养达不到，反倒会产生生长抑制，我们就和外周血CIK一样1-2*106的初始接种密度，后期补液根据生长状况进行调整，增殖效果还是很好的
作者: pengxuleo    时间: 2015-9-23 11:00

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9 i. @- u. o1 A! a5 o( Q( X) K
* d. |& y- |5 W$ e是可以的，CIK的主要效应细胞是CD3CD56双阳性的细胞的。但是一般情况下，都会检测一下T细胞、NK细胞等，所以就检测CD4,CD8,CD16等了
作者: j1370033569    时间: 2015-9-23 16:36

脐带血CIK细胞跟自体外周血培养差不多，只是离心速率及时间问题，比自体稍微大点，吸取白膜层大概能吸取5毫升左右。6 ^' d, Y) W3 j% `: L6 |; S- @
脐带血比外周血培养时红细胞较多，后面不一定死的完。密度一般是保存在1.0-2.0*10^6个/ml左右。



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