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标题: 如何使淋巴细胞分离液密度梯度离心后分离的细胞层明显清晰？ [打印本页]

作者: 地球外世界 时间: 2015-9-16 11:13 标题: 如何使淋巴细胞分离液密度梯度离心后分离的细胞层明显清晰？

如何使淋巴细胞分离液密度梯度离心后分离的细胞层明显清晰？可能是离心机的使用，转速调制3200r,单核细胞层仍有部分红细胞或其他细胞，分离出的细胞层不明显。

作者: wangzhiqi86 时间: 2015-9-16 12:43

把你要分离的细胞混合液慢慢的滴加到淋巴分离液上，最好沿着离心管壁流下，离心机的上升和下降都要选择最慢加速度，因为淋巴分离液是根据单核细胞、红细胞和其他细胞的密度分离开的，这几种细胞的密度本来就相差不大，所以一定要慢。如果离心结束后，中间有一层薄薄的白色细胞层，那就是单核细胞，离心管轻拿轻放，切忌过猛。

作者: shan 时间: 2015-9-16 14:49

转速2000试试

作者: 月_幻影 时间: 2015-9-16 15:01

加液是手法缓慢些，可倾斜离心管沿着管壁缓慢加入，放入和取出离心机的过程也要注意不要晃；离心转速有些高，建议下调

作者: genhaoxin 时间: 2015-9-16 15:19

把要分离的细胞混合液缓慢的加到淋巴细胞分离液上，细胞层和淋巴细胞分离液分界层不被打破，离心力400g，下降时加速度调到最慢，离心管在整个操作过程轻拿轻放。

作者: 鸵鸵 时间: 2015-9-16 15:43

3200r的转速过高，会损伤所需的细胞，建议下调，2000r左右就够了，缓慢加液，慢升慢降，另外不同厂家的ficoll分离出来的效果也是不同的，国产的没有进口的效果好，你可以换下品牌试试

作者: jinhaifeng 时间: 2015-9-17 14:28

血液和生理盐水稀释的比例应该是差不多1:1，离心的话不应该看离心转速，因为各个牌子的离心机是不一样的，建议800g，25-30分钟，你可以试试，效果应该会很好

作者: 地球外世界 时间: 2015-9-17 16:16

回复 wangzhiqi86 的帖子 w" i4 k# w6 U r: q( y& f
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非常感谢，离心机最慢加速度的原因没有考虑到。加细胞混合液时速度和时间不太好控制。

作者: 地球外世界 时间: 2015-9-17 16:17

回复 shan 的帖子# i5 d$ U: W8 n! a) ?5 ], R

好的，我试一下，谢谢

作者: 地球外世界 时间: 2015-9-17 16:20

回复月_幻影的帖子: e0 v6 c/ X- Z, S3 S9 A
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离心管倾斜，如何控制平衡？此时需沿壁缓慢加入，有点难度。求教妙招？

作者: 地球外世界 时间: 2015-9-17 16:22

回复 genhaoxin 的帖子4 i/ E( b+ v& C

明白了，需要注意的地方挺多的，实际操作还需要常练习

作者: 地球外世界 时间: 2015-9-17 16:27

回复鸵鸵的帖子7 I% L& K' u& T; n5 O
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好的，还没对比做过实验。会试一下

作者: 地球外世界 时间: 2015-9-17 16:28

回复 jinhaifeng 的帖子) h8 f5 u5 a. } t. M) R7 ?
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800g是如何衡量的？( h# g* O! d$ K9 T1 j, g

作者: jinhaifeng 时间: 2015-9-18 09:09

回复地球外世界的帖子+ P% o; @/ s- O4 d1 g* W

离心力啊，各种牌子的离心机离心速度不一样，但是离心力肯定都通用的

作者: 小刘 时间: 2015-9-18 10:43

你可以放到离心管架子上，贴着它的壁，然后把面铺好，慢慢左右来回往下划就行，这样保险 h9 ^* [1 p0 X

作者: 月_幻影 时间: 2015-9-18 13:45

回复地球外世界的帖子
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左手握管（手背向外）向右侧倾斜，得到一个淋巴细胞分离液的斜面；右手持枪使移液管口轻靠在离心管内靠管口的位置（正对着你的管壁口处），缓慢加液，液体会随着管壁流下然后与淋巴细胞分离液接触，然后慢慢加并缓缓立起离心管，加液完成时刚好离心管也就回归到竖直状态。至于平衡问题，左手握管后手直接放在台面上即可，加液过程中仅使用手腕力量立起即可。希望可以帮到你~

作者: 地球外世界 时间: 2015-9-18 15:17

回复小刘的帖子) z) z0 Z6 D% x" }2 u: [7 `2 C

嗯，我试试，谢谢

作者: 地球外世界 时间: 2015-9-18 15:22

回复月_幻影的帖子0 v8 Z6 n9 _& n6 ?9 f: X
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非常感谢，说明的很详细，我能想象着做到，平衡问题，得多练习几次，估计会好些

作者: 月_幻影 时间: 2015-9-18 16:46

回复地球外世界的帖子$ x! B* I- @; I

嗯、多练习几次熟练了就好了，祝成功~

作者: 地球外世界 时间: 2015-9-20 10:07

回复 jinhaifeng 的帖子
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那么意思主要还是要看离心力的

作者: 地球外世界 时间: 2015-9-20 10:07

回复月_幻影的帖子

嗯嗯，谢谢指点

作者: 121qwq 时间: 2015-9-22 08:46

主要是下降时加速度调到最慢，离心管在整个操作过程轻拿轻放。你能做到这个，基本上没问题了。

作者: edwardellen 时间: 2015-9-22 21:35

我们操作的经验是400g比较好，转数要根据你们的离心机自己调，离心20分钟，要用低温离心机，用透明度好的离心管。2 m: ^8 o/ K# ?$ V; `
血可以用生理盐水1:1稀释混匀之后再加到分层液上。, j6 ^! E# C1 f
所有的操作，动作不要剧烈，心平气和，手要稳。* H+ W* I. `$ U, ]. q' A
加血的时候，动作轻缓，将血滴到管壁上，让血滴慢慢滑落到分层液上。
标记什么的提前做好，不要把东西都加完了，才想着标记什么的，晃动带样本的管子。
离心结束后，尽快吸白膜层，尽量不要吸到分层液。
如果你都做到了，还是分层不好，那有可能是血的问题，毕竟每个人的健康状况都不一样，不是每个人都跟教科书一样健康，个体差异都是难免的。

作者: myylovewp 时间: 2015-9-23 16:16

2000-2500转/分，一定把降速设置一下（慢降），温度也会有影响，要20度左右吧。

作者: fangtaoye 时间: 2015-9-25 09:01

要慢慢的把样品加到淋巴分离液，沿着管壁慢慢加入即可，我们的比例是分离液比样品1：2的比例，然样品浮在分离液上面，拿的时候千万小心，尽量不要晃动，另外，楼主的转速太快了，我们是600G，还有就是降速的时候尽量慢。

作者: momoenn 时间: 2015-9-25 12:15

1.离心时要慢升慢降；离心机要稳，你可以在离心的时候把离心机装满，不要只单独离心两个管。2 p/ G& f8 R! a. M$ c
2.离心转速和血量也有很重要的关系，如果50ml以上血液，可以采用600g转速，离心25min试试。0 c* E1 ?% q: t# Q5 e
3.离心效果和血液来源关系也不小，一样的过程，一样的条件，用外周血的话，白膜层回比较干净一些；但是如果是脐血，或多或少都会有红细胞。个人觉得ficoll分离用的是密度梯度离心，脐血各种细胞的密度和成人外周血相比可能还是有一定程度的差别。0 P: L F0 a; M7 O: o
4.温度，一定要控制在20度左右，还是因为是密度梯度离心，各种试剂的密度都是在20度条件下测得。

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