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标题: 【讨论】骨髓间充质干细胞分离、培养及传代问题 [打印本页]

作者: lizhen 时间: 2009-4-20 11:53 标题: 【讨论】骨髓间充质干细胞分离、培养及传代问题

现在正在养猪和人的骨髓间充质干细胞，遇到一些问题，也查了园内一些资料，但是说法不一，在此提出请大家帮助：# S) d7 Y# j2 N6 Q! G, u3 V# w
3 R! _ C; K! j# @. i! E, {: f
1. MSCs用percoll法分离的时候，首次离心的时候转速需要多少，我用的是800g/30min，（我看有的是900g/15min，还有其它的，是不是根据物种有所不同）。离心的时候温度需要控制在多少，是室温还是4度，如果是室温，随着离心是不是温度会逐渐升高？3 ?- [9 M8 w2 H" @, K

2. 骨髓向Percoll分离液加样离心后，出现4层结构，然后是用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进夜间吸取单个核细胞层？% L! Y7 L' H' H2 c

3. MSCs传代的时候，终止消化吹打混匀后是需要离心还是直接分别接种到新的培养瓶中，有人说需要离心是洗掉EDTA，也有人说没有必要因为培养基中的Ca会与EDTA螯合使其失效，离心反而会伤害细胞，大家传代的时候用不用离心，参数如何?
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4. 人的MSCs与猪的分离方法有什么区别？我作猪的可以分离出厚厚的一层细胞，而人的采用相同的方法（只是percoll配的密度不一样）只有薄薄一层，不知道大家有什么经验？

作者: wojoo 时间: 2009-4-20 11:54

1）离心1000/5min/RT
2)可以直接吸取
3）应该离心，消化后液体中有酶和EDTA，必需去处

作者: hbling2003 时间: 2009-5-6 21:04

我分离人骨髓间质干时，首次离心为2000rpm/min,20min. 温度最好设置在20℃左右，吸取单个核细胞层时，直接将吸管插入到细胞层吸取，避免吸取到下面的粒细胞层和红细胞。传代的时候最好在低速下离心洗涤除去消化液，800—1000转/分

作者: smartrabbit 时间: 2009-6-19 15:51

我以2000rpm/min,20min离心，我们实验室的人传代时不离心，直接传代，细胞状态很好

作者: gact 时间: 2011-8-23 19:18

回复 lizhen 的帖子; x& q1 M, n; b1 i' W4 K0 j
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你在做猪的MSC么？5 o/ x3 [2 R2 H$ S6 E! q
怎么采集骨髓的么？
用什么型号的骨刺针？

作者: hygene 时间: 2011-8-23 22:17

本帖最后由细胞海洋于 2011-8-24 01:09 编辑
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回复 lizhen 的帖子& k5 H Y4 J" N; E" L
, G. Q+ ?/ E0 S
1、离心1000g,10分钟，室温
2、直接伸进去吸取单核细胞层

3、不用离心（作猪BMSCs未离心传代20多次）+ ~% @( L2 }; x1 Y, F: r# u' Y' T9 G
4、从样品中分离的细胞量不一样

作者: 神经干 时间: 2011-8-24 08:22

1首次离心用常温就可以了，我们之前分骨髓单个核细胞比较过4度和常温，差别不太大，离心时温度会逐渐升高的。
2以我的经验觉得先吸掉上清比较好，因为你不能保证在吸单个核时不吸到上层液体，如果熟练了可以直接吸的，看你个人了，这个应该没有什么硬性规定吧2 b' N+ d5 |- e( V' f% E
3传代时以1000r离心，因为胰酶中可能含有损伤细胞的物质，影响细胞生长% ]2 j$ d O; k) U, Z
4猪的我没做过，不过不同的人的MSC的分离分出的白膜层也是不一样的

作者: wangweilie0418 时间: 2011-8-24 10:24

我们做人的MSC，首次离心式r，25min，吸取白膜层的时候是直接取。不过我们的分离液用的是ficoll。至于传代时我们一直是离心的，这样可以去除残留的胰酶等对细胞生长没有帮助的杂志。

作者: wangweilie0418 时间: 2011-8-24 10:25

不好意思，首次离心式2500r，20min

作者: RIVA2011 时间: 2011-8-25 13:33

首先：
我们是这样做的
1. 首次离心的时候转速2000rpm 15min，传代离心1000rpm 离心的时候温度4度，至于是多少，我认为离心时间不长对细胞的影响不大。" F2 H* L: G: i0 ]7 I* l: ^# @
2. 至于用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进液间吸取单个核细胞层，这不是关键，关键是不要吸到杂质细胞。
3. 消化后，为了避免残留的胰酶等对细胞生长。我们要离心。

作者: 君鸿 时间: 2011-8-29 09:07

我是做胎盘间充质干细胞的，我们已经在供临床使用了，技术已经比较成熟了，我们从胎盘分离出的时候，用percol分离时是1500R，20度，15分钟，我们取中间的灰白层，直接吸，不用吸上清，后面用PBS重悬再次离心即可。传代时技术需要离心，用培养基重悬均分即可。

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