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标题: 贴块法培养MSC,脐带的处理若干问题 [打印本页]

作者: jifengtang    时间: 2015-11-3 21:42     标题: 贴块法培养MSC,脐带的处理若干问题

最近一直在培养脐带间充质干细胞,对于脐带处理流程有些问题需要求教一下:& B3 C6 c' C' H
一、首先我想问一下脐带的结构,看到网上有一些说法,脐带最外层是羊膜组织,再里面是华通氏胶,再往里是比较松软的结缔组织,里面包裹2根动脉一根静脉。
& J, s' p9 C+ S4 j4 p二、我处理的流程:是把脐带冲洗后剪成小段,除去血管里残留的血,将脐带从中间剖开,去除静脉动脉和结缔组织,用手术刀切成2mm3的小块,然后贴块,培养瓶先用血清润洗。/ N3 s/ \! a1 s# V

, y5 R% W/ L# w8 c* v问题1:, i# {) v0 L+ I
网上看到的脐带结构的说法是否准确?: `. }; c% N; e
问题2:; E& c! g5 i7 J2 b
处理时不剥离羊膜,原代细胞爬出影响有多大?7 e' x) j, a& [9 W/ Z8 K. H
问题3:
* X& p! P! O1 g+ q$ A) s- s里面的结缔组织是否需要去除,如果去除不干净会有什么影响?
6 R: w, |, P# @1 H/ i问题4:
; v* Z( j; l" A4 ]一般最后都是用剪刀剪碎华通氏胶,用手术刀切成小块有什么不一样?' q8 I5 q& h% V! ^$ H

作者: wuhuaguo88l    时间: 2015-11-4 11:46

问题1:网上图片还是比较准确的  \" a3 W& v, m, h
问题2:一般是要去除羊膜的
. c: O: f. L' @2 r问题3:去除三根血管和羊膜后,剩下的都可以用来做原代8 X$ S% O# ^/ ^6 o6 ?
问题4:剪刀剪碎比较方便,手术刀貌似不好用。
作者: haibara007007    时间: 2015-11-4 15:33

1:结构非常准确,就是这个样子
7 N, N- Z! ~/ L2:去除比较好,不然细胞会有一些显上皮状4 ^9 T, Z- u+ ^8 u0 H8 f# w. y
3:可以不去除  C0 \3 s) A/ ]
4:一般都是用剪刀,区别的话,这个还真没做过
作者: chuanbaozang    时间: 2015-11-5 10:34

同意楼上几位的回答
作者: fuyinsheng    时间: 2015-11-5 10:38

1、结构没有问题
9 @4 P0 i; ?  }2、一般需要将华通式胶单独分离下来,以确保细胞纯度,因为羊膜上皮细胞生长条件与间充质相似,已造成混杂7 a7 T3 Y1 W6 ?- p1 [% A# B
3、去除血管的同时尽量将残留的血管壁等杂志从华通式胶上分离下来
- m, O  H- J+ K( G4、刀切的组织块相对较大,降低了细胞爬出的效率,剪刀更细碎一些
作者: 月_幻影    时间: 2015-11-5 14:19

1.结构正确;$ i8 O' B; y5 Q7 h
2.做原代一般建议剥离羊膜;' |6 r) ]: o. x
3.我们做的时候一般是将脐带剖开,去除三根血管然后直接用镊子从羊膜上往下撕华通式胶;
3 u; a! d1 J% Z( h- b4.通常使用剪刀剪碎后铺瓶培养,用刀切似乎不太方便也没有剪刀剪得碎。
作者: jifengtang    时间: 2015-11-5 17:11

回复 haibara007007 的帖子8 a* S5 m$ s/ s4 f2 ~5 f6 F
5 E& r2 v0 s1 B( I
我刚做时间不长,羊膜和华通氏胶有些分不太清楚,请问羊膜厚度大概有多少?
作者: fuyinsheng    时间: 2015-11-12 16:38

回复 jifengtang 的帖子
0 Z. k7 p! U5 x
% o7 x' C" g$ b* J$ `2 T, M* [- I# S羊膜非常薄,百十微米左右,最外面一小层
作者: 小豆芽    时间: 2015-11-27 14:20

1、结构式正确的;
7 i4 d" D% R8 G; g0 F2、在组织块贴壁培养时,一般是需要剥离羊膜的,这样可以保证细胞的纯度,同时也有利于细胞爬出;
$ l3 D- u7 H% t3、最好是能够去除,当然不去除也不会有太大影响,可以进行原代培养;
0 j6 d9 a) Q0 S4 T. S4、用刀切的话,操作不如剪刀方便,而且刀切组织块比较大,没有剪刀剪得碎。
作者: redmaple    时间: 2015-11-27 14:29

为保证细胞的纯度,还是要剥离;
( G; A. ?5 E5 `' Z& G8 L不剥离,杂质太多,影响细胞的生长
作者: woshibotao_01    时间: 2015-11-27 16:18

1,说法我觉得靠谱,结缔组织我看到过的。不是很明显。
: Q* Q! ]5 Q5 n* _: i2.把膜剥离是好的,羊膜贴上不但阻碍华通胶跟底面接触,而且还会爬出上皮细胞样状杂细胞。不剥离的话,影响肯定是有的,但不是很大,因为杂细胞在传代后会淘汰掉的。1 G2 e) k2 U$ B" d
3,没有去除,感觉影响不大。0 Y) I# Y; t% o" b
4.手术刀不好用,剪刀更方便。
作者: tlms1991    时间: 2015-11-30 01:43

回复 小豆芽 的帖子6 h/ ~* A) Y4 W
2 K- F/ {$ V3 }+ {
怎样可以让组织块贴的很牢?我的总是飘起来,求赐教!
作者: 小豆芽    时间: 2015-11-30 13:49

回复 tlms1991 的帖子
$ D0 N( M8 ?, j; U  s2 G+ M) U+ g/ J" K& W$ l' S  `! T! l
脐带处理时去掉羊膜、动脉、静脉,将华通胶剪碎大约3mm3,将剪碎的华通胶均匀铺开,倒置放置4-6小时添加培养液。在培养过程中注意尽量不要晃动。
作者: 正义的花生    时间: 2015-12-2 00:06

回复 小豆芽 的帖子
" [3 i7 f  Y2 V8 b% y  c. }" S; \  b
我现在做的是剪成2CM左右小段后  剪刀穿过静脉从中剪开  然后刮掉静脉壁  剥出两根动脉  再私下胶质  8 m$ T3 X4 I, H8 ?
请问下静脉壁不刮干净的话影响大吗
作者: 小豆芽    时间: 2015-12-2 13:12

回复 正义的花生 的帖子
: m/ Q0 L- L" q% e3 L$ @/ B$ L9 b9 l- \; C; ^7 F+ y3 C
影响不是太大,在培养的过程中,细胞也是会慢慢纯化的
作者: tlms1991    时间: 2015-12-4 13:11

回复 小豆芽 的帖子
$ Q7 m9 m7 n/ V* I( m& K
% o0 S2 `) e& \1 A谢谢哈!我试试。
作者: 2013sp    时间: 2015-12-8 11:07

1:准确!
1 v6 `( R7 ^1 R, ]% ?; ?4 x$ B& {, S! o! c" J5 U
2:我认为影响不大。
# m  ?& Q% [% _  ~( ~9 Z: u; v6 n4 A6 A9 @! H. h
3:我建议把结缔组织去除,因为脐带外表面与皿底接触很难爬出细胞。4 I# M* p" F% u" v2 g
( |' v% N% p: B* L  i& N
4:手术刀切的比剪刀剪的大的多,也有文献说手术刀如果切的大小合适,效果很好!9 U- o( j# r. D

作者: optimus    时间: 2016-1-21 09:47

我们没有去除羊膜,只是剥离了血管。做出来效果也还是很好的。
作者: zhangjieyctc    时间: 2016-1-21 15:19

回复 wuhuaguo88l 的帖子4 b/ m' e+ ]  n7 |' c

5 ^4 C- M9 g1 \6 e. q& b结构既然没错的话,那结缔组织在里面没有影响嘛?
作者: firstaider    时间: 2016-2-3 14:46

回复 jifengtang 的帖子+ ?* t1 y7 Y* ?, C# f8 s0 d  y
8 [/ O5 d9 B: L6 _' [! ^! Q
问题1:
% D8 S/ P: Q# g) {脐带结构的说法准确7 @9 ^+ U* B6 C' q. P/ V) D4 H
问题2:
& f7 \4 \8 P7 i" ~' M' `# f处理时不剥离羊膜,上皮细胞会影响原代细胞爬出
% w* B  S! M$ T问题3:( u# `. t, E. W9 K0 U3 o2 W
里面的结缔组织不需要去除,否则华通氏胶得率太低
. @! w  M3 W& n7 w& L问题4:
  S4 R- I/ z- y$ b2 x9 H& X* |) D一般最后都是用剪刀剪碎华通氏胶,用手术刀切成小块降低了细胞爬出的效率
作者: jifengtang    时间: 2016-2-12 21:44

回复 firstaider 的帖子
9 L( l" o7 _/ H& Z+ B1 W! ], H
7 g! S; N) n4 v# A/ o非常感谢!!!
作者: happy_noel    时间: 2016-2-15 16:51

1.解剖结构准确,是这个样子。0 l+ y! B; _2 t; K
2.不剥离羊膜,对爬出细胞影响不大,杂细胞都可以通过换液去除掉。
7 m) s# e/ [8 B2 n! P- s7 a3.里面的结缔组织不用去除干净,没有太大影响。
$ \  D' c: C) z8 W. y4.用剪刀比用手术刀好操作。
作者: suruyu    时间: 2016-2-19 14:17

1、结构式正确的;
2 O7 A: S0 k& _) V2、我们不剥离,细胞状态一直很好,纯度也高;
! v  P0 u% p1 `5 E0 V3、我们通常都是直接剥离完3根血管,剩下组织全部贴壁培养了,木有问题;
- F! Z, z; g7 |6 n0 j; V+ g, g4、用眼科剪很容易操作。
作者: jifengtang    时间: 2016-2-24 12:56

回复 suruyu 的帖子/ B+ u$ S$ w4 ]4 k$ F& @
! s# C  |  x9 u) T2 H* Q4 Z
非常感谢!!!
作者: tingting2113    时间: 2016-3-1 10:22

回复 jifengtang 的帖子3 \$ H+ V- B( k
1 ^9 d; k4 c$ }/ `0 @3 o9 F9 D  _
1、结构准确
2 K3 k  w" }8 e2、不剥离羊膜爬出的细胞比较杂,影响后续使用。
/ T3 r% O: B! i; L3、我们没有去处结缔组织这一步。
% C* c, p' m) H" k" y(1)纵向剖开脐带小段(我们一般直接用组织镊撕开)。/ N  {& q/ ~- x- Q4 p4 e. u2 [
(2)去除三根血管,其间静脉壁比较薄,去除是时候要注意,如果去除不干净,培养的细胞中可能会混有静脉内皮细胞。+ Z/ c' Q( V9 P, y9 @! w# e. b
(3)此时静脉已展开呈现片状,直接用组织镊撕取华通氏胶,避开最下层的羊膜,也就是脐带的最外层。" b- X0 g6 B5 ~+ h
(4)剪碎,培养。
! ?  c8 q7 \& G1 n' \  d7 k4、手术刀切的快块比较大,另外操作过程暴露面大。剪的话,直接把华通氏胶放在离心管里,剪起来很方便。
作者: 晗晗    时间: 2016-4-18 11:07

1.网上说的没有问题
( m! e% V8 c/ H% B2.3.组织贴壁法这些可以都不用去除,要是酶消化法就需要剔除外面的羊膜0 N  v' S6 x0 R6 n/ r8 T
4.还是用手术剪把,因为那个东西有点滑,比较艮,用手术剪比较方便
作者: saliai2016    时间: 2016-4-19 10:03

最好将羊膜去掉,可以保证细胞的纯度;
+ X+ m& y' q2 \4 |4 r至于手术刀和剪刀的问题,个人觉得,剪刀可能更好操作一些,剪得碎了爬出来细胞的概率相对大些。




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