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标题: 贴块法培养MSC，脐带的处理若干问题 [打印本页]

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作者: jifengtang    时间: 2015-11-3 21:42     标题: 贴块法培养MSC，脐带的处理若干问题

最近一直在培养脐带间充质干细胞，对于脐带处理流程有些问题需要求教一下：& B3 C6 c' C' H
一、首先我想问一下脐带的结构，看到网上有一些说法，脐带最外层是羊膜组织，再里面是华通氏胶，再往里是比较松软的结缔组织，里面包裹2根动脉一根静脉。
& J, s' p9 C+ S4 j4 p二、我处理的流程：是把脐带冲洗后剪成小段，除去血管里残留的血，将脐带从中间剖开，去除静脉动脉和结缔组织，用手术刀切成2mm3的小块，然后贴块，培养瓶先用血清润洗。/ N3 s/ \! a1 s# V

, y5 R% W/ L# w8 c* v问题1：, i# {) v0 L+ I
网上看到的脐带结构的说法是否准确？: `. }; c% N; e
问题2：; E& c! g5 i7 J2 b
处理时不剥离羊膜，原代细胞爬出影响有多大？7 e' x) j, a& [9 W/ Z8 K. H
问题3：
* X& p! P! O1 g+ q$ A) s- s里面的结缔组织是否需要去除，如果去除不干净会有什么影响？
6 R: w, |, P# @1 H/ i问题4：
; v* Z( j; l" A4 ]一般最后都是用剪刀剪碎华通氏胶，用手术刀切成小块有什么不一样？' q8 I5 q& h% V! ^$ H

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作者: wuhuaguo88l    时间: 2015-11-4 11:46

问题1：网上图片还是比较准确的  \" a3 W& v, m, h
问题2：一般是要去除羊膜的
. c: O: f. L' @2 r问题3：去除三根血管和羊膜后，剩下的都可以用来做原代8 X$ S% O# ^/ ^6 o6 ?
问题4：剪刀剪碎比较方便，手术刀貌似不好用。

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作者: haibara007007    时间: 2015-11-4 15:33

1：结构非常准确，就是这个样子
7 N, N- Z! ~/ L2:去除比较好，不然细胞会有一些显上皮状4 ^9 T, Z- u+ ^8 u0 H8 f# w. y
3：可以不去除  C0 \3 s) A/ ]
4：一般都是用剪刀，区别的话，这个还真没做过

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作者: chuanbaozang    时间: 2015-11-5 10:34

同意楼上几位的回答

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作者: fuyinsheng    时间: 2015-11-5 10:38

1、结构没有问题
9 @4 P0 i; ?  }2、一般需要将华通式胶单独分离下来，以确保细胞纯度，因为羊膜上皮细胞生长条件与间充质相似，已造成混杂7 a7 T3 Y1 W6 ?- p1 [% A# B
3、去除血管的同时尽量将残留的血管壁等杂志从华通式胶上分离下来
- m, O  H- J+ K( G4、刀切的组织块相对较大，降低了细胞爬出的效率，剪刀更细碎一些

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作者: 月_幻影    时间: 2015-11-5 14:19

1.结构正确；$ i8 O' B; y5 Q7 h
2.做原代一般建议剥离羊膜；' |6 r) ]: o. x
3.我们做的时候一般是将脐带剖开，去除三根血管然后直接用镊子从羊膜上往下撕华通式胶；
3 u; a! d1 J% Z( h- b4.通常使用剪刀剪碎后铺瓶培养，用刀切似乎不太方便也没有剪刀剪得碎。

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作者: jifengtang    时间: 2015-11-5 17:11

回复 haibara007007 的帖子8 a* S5 m$ s/ s4 f2 ~5 f6 F
5 E& r2 v0 s1 B( I
我刚做时间不长，羊膜和华通氏胶有些分不太清楚，请问羊膜厚度大概有多少？

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作者: fuyinsheng    时间: 2015-11-12 16:38

回复 jifengtang 的帖子
0 Z. k7 p! U5 x
% o7 x' C" g$ b* J$ `2 T, M* [- I# S羊膜非常薄，百十微米左右，最外面一小层

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作者: 小豆芽    时间: 2015-11-27 14:20

1、结构式正确的；
7 i4 d" D% R8 G; g0 F2、在组织块贴壁培养时，一般是需要剥离羊膜的，这样可以保证细胞的纯度，同时也有利于细胞爬出；
$ l3 D- u7 H% t3、最好是能够去除，当然不去除也不会有太大影响，可以进行原代培养；
0 j6 d9 a) Q0 S4 T. S4、用刀切的话，操作不如剪刀方便，而且刀切组织块比较大，没有剪刀剪得碎。

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作者: redmaple    时间: 2015-11-27 14:29

为保证细胞的纯度，还是要剥离；
( G; A. ?5 E5 `' Z& G8 L不剥离，杂质太多，影响细胞的生长

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作者: woshibotao_01    时间: 2015-11-27 16:18

1，说法我觉得靠谱，结缔组织我看到过的。不是很明显。
: Q* Q! ]5 Q5 n* _: i2.把膜剥离是好的，羊膜贴上不但阻碍华通胶跟底面接触，而且还会爬出上皮细胞样状杂细胞。不剥离的话，影响肯定是有的，但不是很大，因为杂细胞在传代后会淘汰掉的。1 G2 e) k2 U$ B" d
3，没有去除，感觉影响不大。0 Y) I# Y; t% o" b
4.手术刀不好用，剪刀更方便。

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作者: tlms1991    时间: 2015-11-30 01:43

回复 小豆芽 的帖子6 h/ ~* A) Y4 W
2 K- F/ {$ V3 }+ {
怎样可以让组织块贴的很牢？我的总是飘起来，求赐教！

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作者: 小豆芽    时间: 2015-11-30 13:49

回复 tlms1991 的帖子
$ D0 N( M8 ?, j; U  s2 G+ M) U+ g/ J" K& W$ l' S  `! T! l
脐带处理时去掉羊膜、动脉、静脉，将华通胶剪碎大约3mm3，将剪碎的华通胶均匀铺开，倒置放置4-6小时添加培养液。在培养过程中注意尽量不要晃动。

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作者: 正义的花生    时间: 2015-12-2 00:06

回复 小豆芽 的帖子
" [3 i7 f  Y2 V8 b% y  c. }" S; \  b
我现在做的是剪成2CM左右小段后  剪刀穿过静脉从中剪开  然后刮掉静脉壁  剥出两根动脉  再私下胶质  8 m$ T3 X4 I, H8 ?
请问下静脉壁不刮干净的话影响大吗

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作者: 小豆芽    时间: 2015-12-2 13:12

回复 正义的花生 的帖子
: m/ Q0 L- L" q% e3 L$ @/ B$ L9 b9 l- \; C; ^7 F+ y3 C
影响不是太大，在培养的过程中，细胞也是会慢慢纯化的

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作者: tlms1991    时间: 2015-12-4 13:11

回复 小豆芽 的帖子
$ Q7 m9 m7 n/ V* I( m& K
% o0 S2 `) e& \1 A谢谢哈！我试试。

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作者: 2013sp    时间: 2015-12-8 11:07

1：准确！
1 v6 `( R7 ^1 R, ]% ?; ?4 x$ B& {, S! o! c" J5 U
2：我认为影响不大。
# m  ?& Q% [% _  ~( ~9 Z: u; v6 n4 A6 A9 @! H. h
3：我建议把结缔组织去除，因为脐带外表面与皿底接触很难爬出细胞。4 I# M* p" F% u" v2 g
( |' v% N% p: B* L  i& N
4：手术刀切的比剪刀剪的大的多，也有文献说手术刀如果切的大小合适，效果很好！9 U- o( j# r. D

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作者: optimus    时间: 2016-1-21 09:47

我们没有去除羊膜，只是剥离了血管。做出来效果也还是很好的。

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作者: zhangjieyctc    时间: 2016-1-21 15:19

回复 wuhuaguo88l 的帖子4 b/ m' e+ ]  n7 |' c

5 ^4 C- M9 g1 \6 e. q& b结构既然没错的话，那结缔组织在里面没有影响嘛？

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作者: firstaider    时间: 2016-2-3 14:46

回复 jifengtang 的帖子+ ?* t1 y7 Y* ?, C# f8 s0 d  y
8 [/ O5 d9 B: L6 _' [! ^! Q
问题1：
% D8 S/ P: Q# g) {脐带结构的说法准确7 @9 ^+ U* B6 C' q. P/ V) D4 H
问题2：
& f7 \4 \8 P7 i" ~' M' `# f处理时不剥离羊膜，上皮细胞会影响原代细胞爬出
% w* B  S! M$ T问题3：( u# `. t, E. W9 K0 U3 o2 W
里面的结缔组织不需要去除，否则华通氏胶得率太低
. @! w  M3 W& n7 w& L问题4：
  S4 R- I/ z- y$ b2 x9 H& X* |) D一般最后都是用剪刀剪碎华通氏胶，用手术刀切成小块降低了细胞爬出的效率

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作者: jifengtang    时间: 2016-2-12 21:44

回复 firstaider 的帖子
9 L( l" o7 _/ H& Z+ B1 W! ], H
7 g! S; N) n4 v# A/ o非常感谢！！！

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作者: happy_noel    时间: 2016-2-15 16:51

1.解剖结构准确，是这个样子。0 l+ y! B; _2 t; K
2.不剥离羊膜，对爬出细胞影响不大，杂细胞都可以通过换液去除掉。
7 m) s# e/ [8 B2 n! P- s7 a3.里面的结缔组织不用去除干净，没有太大影响。
$ \  D' c: C) z8 W. y4.用剪刀比用手术刀好操作。

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作者: suruyu    时间: 2016-2-19 14:17

1、结构式正确的；
2 O7 A: S0 k& _) V2、我们不剥离，细胞状态一直很好，纯度也高；
! v  P0 u% p1 `5 E0 V3、我们通常都是直接剥离完3根血管，剩下组织全部贴壁培养了，木有问题；
- F! Z, z; g7 |6 n0 j; V+ g, g4、用眼科剪很容易操作。

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作者: jifengtang    时间: 2016-2-24 12:56

回复 suruyu 的帖子/ B+ u$ S$ w4 ]4 k$ F& @
! s# C  |  x9 u) T2 H* Q4 Z
非常感谢！！！

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作者: tingting2113    时间: 2016-3-1 10:22

回复 jifengtang 的帖子3 \$ H+ V- B( k
1 ^9 d; k4 c$ }/ `0 @3 o9 F9 D  _
1、结构准确
2 K3 k  w" }8 e2、不剥离羊膜爬出的细胞比较杂，影响后续使用。
/ T3 r% O: B! i; L3、我们没有去处结缔组织这一步。
% C* c, p' m) H" k" y（1）纵向剖开脐带小段（我们一般直接用组织镊撕开）。/ N  {& q/ ~- x- Q4 p4 e. u2 [
（2）去除三根血管，其间静脉壁比较薄，去除是时候要注意，如果去除不干净，培养的细胞中可能会混有静脉内皮细胞。+ Z/ c' Q( V9 P, y9 @! w# e. b
（3）此时静脉已展开呈现片状，直接用组织镊撕取华通氏胶，避开最下层的羊膜，也就是脐带的最外层。" b- X0 g6 B5 ~+ h
（4）剪碎，培养。
! ?  c8 q7 \& G1 n' \  d7 k4、手术刀切的快块比较大，另外操作过程暴露面大。剪的话，直接把华通氏胶放在离心管里，剪起来很方便。

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作者: 晗晗    时间: 2016-4-18 11:07

1.网上说的没有问题
( m! e% V8 c/ H% B2.3.组织贴壁法这些可以都不用去除，要是酶消化法就需要剔除外面的羊膜0 N  v' S6 x0 R6 n/ r8 T
4.还是用手术剪把，因为那个东西有点滑，比较艮，用手术剪比较方便

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作者: saliai2016    时间: 2016-4-19 10:03

最好将羊膜去掉，可以保证细胞的纯度；
+ X+ m& y' q2 \4 |4 r至于手术刀和剪刀的问题，个人觉得，剪刀可能更好操作一些，剪得碎了爬出来细胞的概率相对大些。

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