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标题: 干细胞老化的问题 [打印本页]

作者: tingting2113 时间: 2015-11-27 10:12 标题: 干细胞老化的问题

最近复苏的间充质干细胞活力总是不好，出现细胞变大，多核，停止生长的现象。但是细胞才第二代第三代左右啊~~是老化了吗？为什么呢？形态类似附图。
大家帮我分析下，有类似经验的，请多多指教。

图片附件: QQ图片20151127100308.jpg (2015-11-27 10:12, 18.04 KB) / 下载次数 328
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作者: baby00000003 时间: 2015-11-27 10:35

图上这个肯定是状态不好，不过也不一定是老化。6 m+ X3 }) D- c+ b# B1 I/ H" {9 i- n
培养条件（培养基、血清、培养箱、接种密度），冻存和复苏的手法什么的也可能有关系
也许做一段时间（1、2个月）就好了

作者: tingting2113 时间: 2015-11-27 10:43

回复 baby00000003 的帖子* a1 Y& ^9 q" I) _7 M
5 e+ }2 f/ y7 ^. {* `
10%胎牛血清的DMEM，培养箱应该没有问题，因为别人的细胞生长的不错。 z2 p8 P5 ], x" h; T% o$ v* a
冻存：冻存液DMSO：胎牛血清=1:9 取0.8ml 配合0.8ml 细胞悬液。（他人冻存，密度不详）
复苏：从液氮罐里拿出来置于塑料手套中，然后之家放在37度水浴中进行，待未完全融化就放进安全柜进一步操作，个人认为时间掌控的还可以。* @- k7 P1 p- ?- L. o: n
现在就是不增殖，如果忍不住给消化了，直接死给我看！！

作者: baby00000003 时间: 2015-11-27 10:53

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虽然不太清楚具体的情况，提高一点接种密度试试看？" {$ @. \! s, G" h9 K t8 C
比如10000/T，看它长得好不好～

作者: zxd962735279 时间: 2015-11-28 09:23

间充质细胞的代次低的话，杂细胞的量比较多，会有些细胞会死掉，还有就是初次复苏的细胞密度应该大些，细胞密度低长的就慢

作者: 帝国黑骑士 时间: 2015-11-30 14:30

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你这是多少倍观察的啊？你冻存以前细胞生长状况如何？下次冻存细胞的时候可以直接用配好的冻存液重悬细胞冻存复苏再试试。

作者: tingting2113 时间: 2015-12-1 08:44

回复帝国黑骑士的帖子( f. \; z N! D" e. n; c& N

不好意思，这个并不是我的细胞的图片，但是我的和这个是一样的。之前是细胞生长状态挺不错的，但是这批细胞挺长时间没用了，期间搬了一次家，但是一直放液氮罐里应该影响不大吧~~% t C0 @& h: _0 V* J2 p
您说的方法我会试试，谢谢

作者: tingting2113 时间: 2015-12-1 08:44

回复 zxd962735279 的帖子

恩，谢谢

作者: tingting2113 时间: 2015-12-1 08:44

回复 baby00000003 的帖子
k( A; q' _$ W1 A* }
好的，谢谢

作者: tingting2113 时间: 2015-12-1 11:49

回复帝国黑骑士的帖子2 y6 M9 \4 ]: c- C5 t. ?
( f9 T8 H% I+ U
实在不好意思呢~~现在还没有权限加好有什么的~~~

作者: 121qwq 时间: 2015-12-1 15:51

接种密度低的话也会出现这种现象，最好以10的5次方接种

作者: yooung 时间: 2015-12-4 09:47

回复 tingting2113 的帖子9 U* s& C$ R9 F/ T
2 _% T) Q& r8 \$ y6 e# |6 E" Q' E6 j
好像在一篇文献中看过，华氏胶组织块在高浓度谷氨酰胺的DMEM培养液中培养3周，细胞体积和细胞核明显增大，细胞呈不规则的多角形。因为细胞培养液中的谷氨酰胺分解产生大量有较强细胞毒性的氨，所以原代培养的培养应尽量新鲜配制，不需要另外添加高浓度的谷氨酰胺。1 a* t3 j# Q5 c5 u8 C
不知道是不是你这种情况。

作者: yooung 时间: 2015-12-4 16:26

回复 tingting2113 的帖子

刚才找到了那篇文献，你可以看看。3 I# ?. _1 c- T' F1 m) a2 e

附件: 人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定.pdf (2015-12-4 16:26, 822.17 KB) / 下载次数 3
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NzM2MTZ8OThkNjkzZDl8MTc5MzQ3MTg1MHww

作者: woshibotao_01 时间: 2015-12-5 23:38

如果你细胞冻之前形态不错的话，而复苏后形态不好，老化，原因我猜测，一是你复苏后接种密度是否过小？二是你的培养基是不是用的和冻存前一模一样？

作者: 雁南飞 时间: 2015-12-9 16:32

看看培养基和血清是不是过期了，或者存放的温度不对，培养基和血清的可能性比较大。

作者: 海南小石 时间: 2015-12-10 14:25

感谢分享，学习了

作者: swtarron 时间: 2015-12-10 16:28

回复 tingting2113 的帖子

待未完全融化？？4 s/ o0 o# g& _1 r9 S3 o. U7 Y
我们复苏的标准时冻存管不能有一点没有融化的，不然复苏的效果就不好，甚至有的时候我们还要看到完全融化后，再放进水浴锅中10s左右。你们复苏的操作标准和我们不一样？

作者: tingting2113 时间: 2015-12-15 10:46

回复 yooung 的帖子# K* U; [- c: q. ]

非常感谢！！

作者: angel-niu 时间: 2015-12-15 20:26

你的细胞是第2-3代，细胞活力应该最旺盛了。从图上看，胞质增加，胞核分裂并没有变大，所以，应该不是老化，像是过劳的“young cell”。如果细胞没有反复冻融的话，是你的复苏过程某个环节出了问题。- d7 n% O8 \/ \; T+ Z! w2 l
1.细胞溶解后，加入培养基，不要吹打和晃动，因为这时细胞最脆弱，任何外力，都会给细胞带来致命的损伤。
2.复苏后不要离心，第2天时直接更换培养液，去掉DMSO。1 V" V. ]; G7 X% t% u
3.冻时间长的话，细胞会丢失很多，加大接种密度。

作者: 海南小石 时间: 2015-12-21 15:30

一般情况下，冻存后的细胞的活力都是不太好的。

恢复活力的常用办法除了添加新鲜培养基之外，还可以往培养基内添加一些细胞因子，白细胞蛋白，灭活的血清等等。细胞的密度也是影响细胞生长的因素。

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