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标题: 关于脐带贴壁的问题 [打印本页]

作者: 忘虚 时间: 2015-12-2 11:23 标题: 关于脐带贴壁的问题

我最近做脐带间充质原代组织培养 1、不知道为什么没有细胞爬出来本来怀疑是染菌但是做了检测却显示没有。
2、网上都说组织块剪成1-2mm3，但是贴壁有一半贴不上，这里面有什么细节么？关于贴壁

作者: 忘虚 时间: 2015-12-2 11:26

还有看到文献上说6-7天就长出来细胞有人做出来过么？我原来养一般都是两周左右。

作者: swtarron 时间: 2015-12-2 13:59

1、接种之后前5天最好不要动培养瓶（皿），防止已经贴壁的组织块脱落。5 N/ {4 n& ^- U, N4 @8 S9 n
2、脐带间充质干细胞存在个体差异性，有的贴壁之后很久才会有细胞爬出来，而且增殖速度也很慢（但一般很少遇到），看楼主是不是遇到个例了。7 G: @( M, R W2 G4 ]7 r

作者: 正义的花生 时间: 2015-12-2 14:59

请问下T175的瓶子加多少培养基比较合适啊

作者: woshibotao_01 时间: 2015-12-2 23:35

你说的没长出细胞是过了多长时间没长出？
剪完后的块要稍微干燥一点，不要太湿，要不容易脱落。脐带活力强的，贴好的话，7天可以爬出细胞的。; j, F/ h8 k, M& \

作者: 细胞海洋 时间: 2015-12-3 13:52

回复正义的花生的帖子4 Z. F7 l2 J# A% y

你回复谁就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容像我这样

否则他会看不到

作者: 月_幻影 时间: 2015-12-3 14:51

回复忘虚的帖子8 L7 ]5 m" I1 H0 I+ X3 O2 V$ J

我做过的脐带中有少部分是一周左右爬出细胞的，大部分是10天左右

作者: 月_幻影 时间: 2015-12-3 14:51

回复正义的花生的帖子* m- w2 j$ f4 |! ^, j0 T; E5 L$ Y
& z4 w+ \) K$ l0 ^- y. t3 {
30ml

作者: zengping120919 时间: 2015-12-3 15:55

回复忘虚的帖子
& D6 T9 v( H, q4 b v# X
才养的，四天就看到有细胞长出来了，今天第六天，已经长了一片了

作者: zengping120919 时间: 2015-12-3 15:58

这个和脐带本身也是有关系的，脐带胶质多的脐带更容易长出来，而且组织块不宜与空气接触时间太久，就要求处理脐带的时间要尽量快。

作者: 2013sp 时间: 2015-12-4 10:33

这有很多因素:1、脐带的粗细，粗的饱满的较好。2、前五天不要移动。3、培养液血清浓度可以提高至15%。

作者: yooung 时间: 2015-12-4 10:54

回复正义的花生的帖子1 f; S; f {7 t( s1 I
2 l& k. p3 T$ _/ I
看细胞密度，一般二三十ml（传代培养）

作者: yooung 时间: 2015-12-4 11:06

回复忘虚的帖子

一看培养基，进口的，含10%胎牛血清的培养基原代培养效果好些) Z( V5 `5 E9 Y/ M% V% \
二是贴组织块，方法很多，可用25cm2培养瓶，将组织块贴上之后，竖直放置，加1ml培养基后放入培养箱放置2~4小时，再平放培养瓶，使组织块完全进入培养基中，继续培养，3天换一次培养液。. G2 ?; e9 P6 c' i1 z+ u
三是培养箱环境对不对？5%co2,37度，饱和水气。

作者: tlms1991 时间: 2015-12-4 13:15

回复 zengping120919 的帖子

可不可以详细介绍下你的做法？我的都是20来天才爬出来，最近竟然都没有动静了。

作者: zengping120919 时间: 2015-12-4 13:53

我们实验室培养感觉挺简单的，没有他们说的那么复杂，脐带从手术室拿出来是放在加了双抗的生理盐水里。处理脐带时，先将整根脐带用PBS溶液洗一遍，然后用75%酒精浸泡大概5分钟，主要是消毒，并且会让脐带表面的羊膜皱起，便于后续处理，在将整根脐带放在PBS溶液中，并将脐带剪成2-3cm的小段。另取一个无菌的玻璃平皿，用来分离脐带，主要是逐段去掉羊膜、动脉和静脉（注意动脉和静脉周围的组织一定要尽量保留，华通胶一定要保留，而且在分离脐带的过程中不能用溶液浸泡分离好的组织），待所有小段都处理好后，将组织剪碎成1mm3的小块，用少量含10%FBS的培养基接种。我们用的是10CM的培养皿，每个皿大概13-15mL培养基。将培养皿放入细胞培养箱中，前三天尽量不要动。如果发现培养基过少，可以适当补液，每个皿大概补2-3mL。除非脐带非常不好，一般一个星期就能长出来，好的话四五天，慢的话不会超过十天。不过我们在培养过程中发现，FBS 真的非常重要，并不是说只要是进口的就一定能长出来，有的批次就是不适合养间充质干细胞。如果你的细胞一段时间内都长不好的话，建议可以换个批次的FBS试试。还有期待尽量选新鲜点饱满的，胶质多的话就更好了。

作者: zsykdx 时间: 2015-12-4 15:42

是不是培养的时间不够？原代培养一般需要7-14天才能爬出细胞，而且在培养过程中不要经常摇晃培养皿。

作者: 正义的花生 时间: 2015-12-4 16:19

回复 zengping120919 的帖子

分离好的组织市剪碎之后就直接种瓶吗？
我现在是把分离好的组织先放在个加了生理盐水的培养皿，全部处理完后加到离心管里离心一下才种的

作者: tlms1991 时间: 2015-12-7 02:19

回复 zengping120919 的帖子* y: \/ d4 X4 t: O: j$ k0 m
5 J# n( h5 v5 u) b" A. U
非常感谢！

作者: tlms1991 时间: 2015-12-7 02:22

回复 zengping120919 的帖子9 I- W* g0 n4 H5 ^ a5 V
s6 g# |3 n* G' k) H8 o
求详细方法。

作者: zengping120919 时间: 2015-12-14 09:41

回复正义的花生的帖子

把所有的组织全部剪碎后直接接种的，要不不好贴壁的吧

作者: jenny114402 时间: 2015-12-14 12:00

回复正义的花生的帖子

我用的是无血清培养基，在20-25ml，我平时都加25ml

作者: zsykdx 时间: 2015-12-17 10:00

组织块铺板后先在酒精灯周围晾晒5min，再加培养基恰好浸没润湿组织块，24h后补液至正常体积，这样做组织块贴附会牢固些，也比较容易爬出细胞

作者: 蜗牛爱贝贝 时间: 2015-12-17 11:51

回复正义的花生的帖子

175组织块建议20ml左右加上组织块后总体积不要超过25 一般我都是总体积在22左右的原代培养不要加培养基太多只有组织块挨到瓶底才有可能爬出细胞来

作者: 蜗牛爱贝贝 时间: 2015-12-17 11:52

回复 zengping120919 的帖子

间充质原代一般不会这么快出来的有可能不是

作者: 蜗牛爱贝贝 时间: 2015-12-17 11:55

种瓶后就不要动了中间过5-7天换下液一般到两周左右肯定是会长出来的尽量不要晃动瓶子 9 v9 }* J! s1 R; e* N
还有就是个然感觉组织块剪的不要太小太小贴壁也不是很好
还有就是培养基加的也不要太多
很容易的

作者: 忘虚 时间: 2015-12-21 16:19

回复 woshibotao_01 的帖子; @! l. ?0 @' @" j
7 n+ Y0 ?% I6 t. Z7 F
谢谢，我采用半干贴最近长得还可以反复看了以前的原因是脐带太差了脐带一点都不白很多都是黏糊糊的胶

作者: 游遍芳丛pine 时间: 2015-12-23 11:38

你说不好贴壁的话刚开始贴壁的时候你的培养基加了多少毫升？
我们一般是制备时先加5ml、次日补加5ml、第三日补加7或8ml，这样应该会比较容易贴住。

作者: woshibotao_01 时间: 2015-12-23 11:50

回复忘虚的帖子8 ]- u N0 A& x1 E! H

不客气。脐带存在的个体差异很大，也和采集时间的长短有关，当然是采集时间越短越好，个体差异就不用多说了，就跟人一样，有身体好的，有体格弱的，你懂。

作者: zengping120919 时间: 2015-12-30 13:08

回复蜗牛爱贝贝的帖子
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这是在脐带非常好的情况下，一般情况下要一周的，而且刚爬出来的细胞只有一点点，如果不仔细找的话，可能看不到

作者: 张杉杉 时间: 2015-12-30 14:57

回复 zengping120919 的帖子

麻烦问一下，您四天长出细胞时，培养基的颜色有何变化？

作者: optimus 时间: 2016-1-21 09:34

我第二次组织块培养，四五天也长出细胞了，但是不多。

作者: 田甜 时间: 2016-2-2 12:58

组织块贴壁法养细胞又不是所有的组织块都会长细胞出来的。其实就是克服一下，不要天天看，天天动。只要不污染，细胞培养皿放置一周后半换液，10天后看看细胞就行，会有惊喜的。一般13天以内，原代就能长到传代的程度。

作者: firstaider 时间: 2016-2-2 16:15

回复忘虚的帖子1 q: K" `$ S0 r& ~
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1、建议加10ml培养基放一周不动即可；
2、大部分贴不上正常，干细胞占比极小。

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