原代间充质细胞0.25胰酶消化多久？

jddakui

原代间充质细胞0.25胰酶消化多久？超过5min会不会有影响，时间短细胞还壁上啊？

木头1102

你细胞密度状态怎么样，或者细胞消化之前有用PBS润洗么？间充质干细胞还是比较好消化掉的，原代虽然难点，但我们一般0.05的胰酶3min也差不多消化掉了

正义的花生

我们做的时候先用生理盐水润洗一下然后弃去，T175瓶子5ml胰酶消化3min。消化的时候左右轻轻晃动瓶身并拍打瓶壁让胰酶充分接触。

hefan1234

首先将旧培养基装到离心管里，用生理盐水润洗去除残留培养基，将0.25的胰酶和生理盐水1:1处理贴壁细胞，一般T75的瓶子（1.5+1.5），T175的瓶子（4+4），如果该原代贴壁特别牢可以增加胰酶比例，但是一般不会要5min这么久，镜下观察大部分细胞开始脱落（可轻轻拍打培养瓶，加速细胞脱落），加入旧培养基终止消化后转入离心管，用生理盐水润洗瓶底(轻轻拍打)后转入离心管，盖紧离心管盖离心。

1195963542

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7 o) R( k0 V8 I0 u' I我们操作是1.在细胞密度大概70-80%的时候，用PBS轻轻洗一遍，弃去  2.加胰酶消化，紧接着观察细胞形态，观察同时时不时拿下来轻轻拍打细胞瓶，使贴壁细胞散落成游离单细胞，当都是散落游离的单个细胞时即可加入培养液终止，时间大概2.5-3分钟，。 3.消化时间是根据观察细胞形态来决定的 ，有时候用的胰酶不同，（比如加不加EDTA）可能时间就不同。

yooung

5 |* ^$ Z* m7 M( J8 `6 X
% ~+ d( P2 P1 Q
我们主要是做传代的，0.25胰酶消化2~4min，操作同楼上。原代MSC就不清楚了，不过消化时间过长，细胞活性可能会受影响的。消化时间短应该留下很多在壁上，特别是培养时间长，消化时细胞密度很大，因为细胞密度很大时，MSC增殖有限，主要是胞外基质的生成和分泌，如此细胞贴壁以及细胞间的连接更加紧密，胰酶更难消化点。

king8

消化细胞的消化时间需要控制，尽量控制在5min以内吧！
! R/ I6 s. S8 i4 y1 n0 W4 k7 l7 w' P需要注意的是：1 o- d9 O( ?; Q0 J( E& e
1、消化前使用PBS冲洗两到三遍，去除培养基。# F+ ~  k/ S% e, G# P: v; p$ v+ ?/ o/ K
2、胰蛋白酶可以提前室温放置一段时间。
# P+ d7 N/ t9 k* A/ P3 t7 q0 ?' T% k3、加入胰蛋白酶后，至于37℃培养箱中消化，3min时，显微镜下观察消化效果。
1 g* ^9 _7 a8 l6 M正常情况下，5min是足够的。

jddakui

回复 hefan1234 的帖子3 W4 Z7 J& l7 M9 b0 z6 ^) v# F( c' |

2 t) ~& H0 }) m$ T/ j我用的DPBS ,用生理盐水 是因为成本还是其他原因呢？一般酶加进去应该是混浊的感觉，但是处理3min'还是清亮的。酶的问题？

jddakui

回复 木头1102 的帖子
) |# D7 ]1 L0 Q& g$ w( o. N2 w* l
原代 是彻底消化下来好，还是控制时间大部分下来就可以了？感觉贴壁很牢啊！

木头1102

我一般大部分消化下来就终止消化了，因为我喜欢用消化法，原代细胞比较杂，杂细胞贴壁比间充质牢固，难消化的有可能是杂细胞，并且消化过度的话影响细胞活力和状态。