细胞倍增曲线的制作方法及原理

king8

细胞增殖的研究方法有： MTT，CCK8，BrdU，EdU，等方法。
; ~! k1 t" Z' D- k7 G3 y1 [- w% _; aMTT检测) M* Q4 e& g; l$ A
MTT检测以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT是一种黄颜色的染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，从而可以对细胞的活力、增殖与凋亡情况进行检测。* Y7 r- v" S, n+ K
CCK8检测
0 {/ `$ ?4 x! i  R& J8 NCCK-8的原理跟MTT是相同的，不同之处在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤，因此可以减少一定的误差，其重复性优于MTT；且对细胞毒性小。8 j: l, r2 w2 R# u9 _$ `( x8 |/ z
Am-Blue方法检测) v% s# T' F' q% ]) `3 y3 o
Am-Blue检测试剂的主要成分是一种氧化还原指示剂。其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，在细胞增殖过程中，细胞内NADPH/NADP、 FADH/FAD、 FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，处于还原环境。在还原状态下，Am-blue转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，其吸收峰为530-560nm，而散射峰为590nm。最后用荧光酶标仪进行检测，吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。Am-blue为水溶性试剂，无需固定、裂解细胞，只需一步操作即可测定，使高通量筛选更高效。不影响细胞代谢、细胞因子的分泌和抗体的产生，细胞仍可进行后续实验。
6 p) l, W9 G& b& j* ^1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液。. ]3 b. Z. x: Z8 x- p3 r8 I
2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。
3 [( U* w4 [$ n' N% N0 ^0 x- x3. 每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。培养3～5 d 常要给未计数的细胞换液。9 s; V& m; N* f% E0 K
4. 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。7 @( t7 D# K) @( x% s5 T1 x
细胞生长曲线：一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。/ B2 G  ]; X- K) y; u1 b0 R
  l7 H& ?3 ~$ Q- C  T: p
需要注意如下：3 l6 \5 d0 r. U/ s3 _( I7 A. T: \8 t
1. 细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分析。% D4 x6 H, a; ?8 V# |9 R
2. 现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。
4 F" |5 d  L7 H$ X4 [0 B3. 标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。% W- H8 j6 q1 B' e9 B) k; N