关于细胞培养支原体污染的检测和处理

cneagle66

最近做肿瘤细胞培养，遇到了支原体污染的问题，小小经验分享一下。
4 z. X. x3 H/ J8 l% e2 G% P0 U1 c8 V; |8 c
前一段时间，细胞长得不好，细胞培养液清亮，但是凋亡比较多，后来细胞几乎不长甚至越死越多。找高手镜下一看，怀疑支原体污染。用了3种方法鉴定后，确定支原体污染无误。下面的任务，就是扔细胞，擦洗培养箱，寻找清除支原体的试剂。重新复苏细胞，都是在再次传代后又不长了，怀疑过去存的种子细胞也有问题。竟然为了这支原体污染，1个多月忙活，实验毫无进展。- p# S( o4 i$ r1 v6 B% K

4 ]* ]" {; `5 g) Q1 B一、首先我用过LONZA的试剂，好像是发光法，具体不太确定，价格太贵（一个样品检测需要1、2百元）。这个毕竟是大公司，做免疫细胞治疗试剂的，应该很可靠；检测一次需要几个小时。
; h2 ?( c0 G) u' ?7 E1 r# p
& V& u+ F% H+ r4 @' W1 [2 h二、自己用DAPI或PI染色，荧光显微镜下观察，这种方法需要一定的镜下识别技术（因为我们并不是经常遇到支原体污染，也不是鉴别支原体的检验人员），其他劣势是：比较粗略；少量污染难以看得出来（不过，少量污染细胞也能很好生长，呵呵）。这一方法的优点是快速方便，但是需要一台荧光显微镜。
) n# _. V5 Z* \+ o$ Y7 x
: C; ]7 P& E' ^+ q三、后来我根据文献，合成了2套PCR引物，一套是巢式PCR引物（内外PCR引物，共计多达7条上下游引物；2次PCR费时费工），另一套是简单两条PCR引物。PCR后两套引物结果一致，只是没有测序验证是否是同类型的支原体了（不过也没必要大动干戈）。
, X9 t* K2 |0 j! I2 J+ f6 \3 w% Q/ k( J" ?, B/ I
经过3种方法的检测结果的互相确认，感觉最后的这一套引物（简单的2条引物）既敏感、又客观，方法简单，只要有一台普通的PCR即可。现在我基本上都是用这一方法，PCR和电泳，2小时出结果。【前引物：GGGAGC AAA CAG GAT TAG TAT CCC T 后引物：TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC 】。退火55-60度均可。  x3 b7 T9 J5 N4 O7 \
+ k. @  i0 |3 ~9 [/ s- ~8 X
但是，如果是做临床治疗的细胞样品，建议还是用CFDA批准的检验试剂，或者公认的公司生产的检验产品，来做最后鉴定。4 X  F4 Y6 u1 c3 x1 [
1 K* ~; B4 D6 m' p& x/ t6 X
关于清除支原体，买了一个试剂，Biomyco 3，100x的，用了以后细胞浑浊，感觉这一清除剂本身也存在污染。又重新滤过，，今天用它配了200ml完全培养基，换细胞培养液，等待结果。因为看文献，说要清除支原体，至少需需要14天以上。后续结果，随后我会贴上来。
+ w1 p' }) I& q- n' Q: L: u& v  ^  e
同时，在丁香通上，找了一家公司，可以试用支原体清除剂。结果送来后，只要大约几十微升（20ul？），记不清了，装在1.5ml管里，用起来不方便。加如培养液以后也没有太大起色，细胞只好扔了。
5 c8 f: Q; D! M9 D2 ]9 |0 ?6 U
9 s* [- Y+ c; q" g; m; y( _培养箱除支原体：买了一瓶500ml的支原体清除喷剂，但是具体效果，也没办法验证，权当去去心病吧。
) [: ^1 i/ N5 g. R- G  `, |
6 Y) Z% ~6 r4 T感觉这次支原体污染，和我的培养环境关系不大。! m  G1 G( a! D0 n# {, a; A, w
4 A1 B+ Q# Q: f* M1 h- |" X; A
看到有网友说，支原体污染，难以避免，一般对细胞生长影响不大，尤其是短期培养。我们原来培养的时候，尽管传了多次代，支原体也没有疯狂生长，为什么最近支原体的影响这么明显，到现在还是个疑惑！！！

ghx2005

据您对支原体检测的了解，做临床治疗的细胞样品，用什么方法，什么检验试剂来做鉴定合适？先谢谢了

cneagle66

我们做临床治疗的细胞制剂，实验室内部检测用Lonza的试剂，然后再输注前留样交由检验科再行检测一次，每个制剂至少有两次检测。检验科的这次，实际上相当于室间质控。检验科的试剂不太清楚了。

小木梅

买支sigma的四环素

cneagle66

细胞经过3次换液，7天的培养，检测了一次支原体，一瓶细胞基本消除，另一瓶细胞PCR条带亮度也明显降低，说明支原体量减少。另外，细胞长势也和以前大不一样，细胞浆更加晶莹透亮。继续去除，14天后再看。

cneagle66

今天更新一下去除支原体培养的细胞状态：8 @# Q2 n5 D) p& h" o/ A+ [7 w
支原体去除剂用了将近14天了，细胞从八九天的时候，有形态变化，原来多角型测细胞，都变成长梭型，而且生长较慢。9 ~6 r) k% o$ |! {5 w: a
综合起来看，应该是支原体去除剂用2次效果最好（2次传代）大概一周时间吧，这时候支原体被抑制，细胞生长、形态都很好。