冻存的MSCs复苏时几乎都死了，怎么办啊？

lijie_suc

前段时间培养了一批MSCs，长的挺好的，后来就冻存了一部分，过了半月再拿出来复苏的时候都死了，实验都进行不下去了，怎么办啊~( s& r6 G) d* i$ W9 S2 k7 A
冻存步骤：1.冻存前一天全量换液
3 ]" e3 O) x. X  w$ _               2.吸弃培养液，PBS冲洗一次。0.05%胰酶37℃消化1.5~2min。5 z- M. [! }; g2 J5 W0 E
               3.加含10%NBS的DMEM终止消化，继续吹打，使细胞悬浮。! W. D6 |: R' h6 R9 J
               4.1000r/min离心5min，弃上清。2 k2 C% X/ _2 L7 M- e
               5.加冻存液1~2ml，细胞计数。约1*105个/ML。
* A' ~) e. v2 i6 r( I% J               6.程序降温：4℃30min--------零下20℃ 60min——零下70℃. t. X1 q. t0 t2 U5 }
复苏：, J" a3 B, a  ?' L( w9 c' I
零下70℃取出——37℃水浴加热至融化，中间不断摇晃加速融化
# F$ y$ S! C$ N  F$ O* E5 o+ a冻存液:基础培养液=1:9混匀，1000r/min离心5min，弃上清，加3ml基础培养液混匀，接种。37℃ 5%CO2 培养箱中培养。: F' R# o; M2 N9 z, K; c
次日观察细胞生长状态，发现细胞悬浮较多，只有几个贴壁细胞。全量换液后，隔天观察，细胞生长及其缓慢。

happy_noel

如果以前一直按照同样的手法细胞没有问题，就要考虑DMSO或者血清等试剂是不是保存不当失效了？从试剂方面找原因吧。或者考虑复苏的时间是不是过长、冻存前细胞活率高不高？细胞冻存了多长时间？-80冰箱是否正常工作。很多方面都影响细胞复苏活率。

yinchong42

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90%血清的话，再复苏的时候细胞有没有可能因为低渗死掉呢？谢谢！

121qwq

1，你冷冻的方法不对；9 b/ z4 w. u( h
2，你冻的时候细胞状态就不好

firstaider

回复 lijie_suc 的帖子4 C% h, C- y) w/ v7 ^0 |6 `
- i4 B% t& ~7 \1 Z" \, B! h# v
1、对于冻存后复苏困难的细胞，冻存液建议加90%血清；
4 I3 o' N7 Z/ e7 P5 }  W7 u# i9 K5 d2、建议提高细胞密度至1*10^6个/ML。

田甜

1.冻存液的问题：你使用的冻存液的配方应该是比较常用的，问题不大，但要看一下，你的DMSO是否适合冻存细胞用。前段时间我冻存了两批细胞，因为DMSO的量不够，一批用的是sigma，一批用的是国产不知名品牌。其它材料和方法一模一样的情况下，复苏后，国产DMSO冻存的细胞，活率极低，sigma的正常。不知道你是否遇到我这种同样的问题。
$ E: V2 G% v9 a2 ~$ X" _4 L- B2.复苏时间：虽然说37℃复苏，不会“烫伤”细胞哈，但是冻存复苏细胞有个原则，慢冻快融，尽量避免细胞在冰点时间过长，导致细胞损伤。我一般复苏用38℃-39℃的水浴复苏细胞，时间控制在1min20s以内，通常看见冻存管内还剩绿豆大小的冰块时，结束水浴，继续溶解就行。
! s- v( z! V/ J6 l$ I3.冻存液添加方式：假设你准备用冻存液10ml，可不可以先用9ml20%FBS的血清培养基重悬细胞后（这个时候可以计数），慢慢滴加1ml的DMSO呢，这样好像可以减少DMSO对细胞的损伤吧。
& R; F$ G, x/ s, p4.其它：个人觉得你冻存细胞的密度也还行吧，看你复苏的体积应该是接种T25，密度应该也不低。总觉得是不是你冻存前，细胞状态就不行啊，计数中没提到活率，如果之前活率就低，又只是冻在-70℃冰箱里，影响还是很大的。冻存前活率就不要低于90%，尽量选择细胞状态好的时候哈，传代次数不易过多。

fuyinsheng

冻存和复苏都是关键步骤，复苏没看到你融化后怎样进行的，但是大体需要注意以下几个问题：/ S8 J8 k+ o. r% b- c$ i. y- ~
1、冻存液中应该加血清或白蛋白保护细胞状态( x; h& r) K6 {  P: J4 y% q
2、加入冻存液过程中是否持续混匀，如果不持续混匀会导致冻存液局部浓度过大杀伤细胞) w2 b( L' c; h% F
3、冻存液是否预冷了，低温才能减少冻存液毒性/ m! R' z0 n2 V1 o6 d
4、你程序降温是用什么来承装细胞的，如果冻存管直接转移的话是起不到缓慢降温的+ ]- g9 l- F) x, y! b1 b- b: N
5、复苏时融化时间不要太长，要保证不完全融化状态才行，尽量缩短溶解后到清洗前的时间
0 G- B% [! k6 a9 ]% z1 A* _6、清洗细胞时最好加些白蛋白或血清，保护细胞

Albertchen

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6 B  a+ J! ^5 \. y1 d
% T" I9 U- y! h3 k不会死，但是会影响细胞的状态，你知道干细胞都是比较矫情的，所以不要等到所有冰晶完全消失才把细胞拿出来，等到即将要全部消失的时候拿出来比较好，个人感觉。。。。

lijie_suc

回复 蚂蚁上树 的帖子
* ~) K) w% O: M% F1 ], f5 E6 c& u1 w8 m1 `/ T7 z, X  O
好的，我会尝试的，谢谢喽

lijie_suc

回复 蜗牛爱贝贝 的帖子& d# o! C# [( ]. x

& I! |$ |$ h$ k, @7 G% q" y嗯，有可能是密度太小了，再一个37°水浴能使细胞热死吗