冻存的MSCs复苏时几乎都死了，怎么办啊？

lijie_suc

前段时间培养了一批MSCs，长的挺好的，后来就冻存了一部分，过了半月再拿出来复苏的时候都死了，实验都进行不下去了，怎么办啊~
7 y2 r# A) u2 e4 U/ B) w6 z冻存步骤：1.冻存前一天全量换液2 S/ f! F  Q6 T3 c) Z. b- n
               2.吸弃培养液，PBS冲洗一次。0.05%胰酶37℃消化1.5~2min。
2 C, p) v; \3 w/ K               3.加含10%NBS的DMEM终止消化，继续吹打，使细胞悬浮。1 S% a: V) n% D
               4.1000r/min离心5min，弃上清。' _& V4 H' Z( z, a8 v
               5.加冻存液1~2ml，细胞计数。约1*105个/ML。" m8 `. G6 F, N& V; x
               6.程序降温：4℃30min--------零下20℃ 60min——零下70℃
0 k' r- A5 {3 y" T7 G% b/ ^/ Y复苏：# @$ U* b: N0 z% {+ Z% Q, z( M9 |
零下70℃取出——37℃水浴加热至融化，中间不断摇晃加速融化
% H7 K+ v7 p+ o( w1 {4 i冻存液:基础培养液=1:9混匀，1000r/min离心5min，弃上清，加3ml基础培养液混匀，接种。37℃ 5%CO2 培养箱中培养。* ~6 d0 q3 K4 z
次日观察细胞生长状态，发现细胞悬浮较多，只有几个贴壁细胞。全量换液后，隔天观察，细胞生长及其缓慢。

小猫狸狸

冻存液不需要加血清吗？加20~30%血清试试

lijie_suc

回复 小猫狸狸 的帖子# ~- J" }% V2 I- y5 n% M  i, J" ]: }
) f: C' w- b6 M: V4 q  K+ Z; b
冻存液：( J5 l" E0 O" H, ?( m
DMSO：血清：DMEM=1:2:7

干细胞观察

回复 lijie_suc 的帖子$ d) s4 r$ Y3 b% |& e, i
' r$ f# i/ n, t" r) x; E
+ o: o* e- }; K1 G0 q1 B
. W, w3 D) z2 k5 H. t3 }1 W# u) c
基础培养液？没加血清嘛？不加血清不贴壁的吧。

lgfffancy

回复 lijie_suc 的帖子
* K9 j. Z5 p$ Q
* q, x' M! w7 `你这个太简单了，你复苏的时候当然是用全培养基，你还用basic medium，请问营养物质从哪里来，不死才怪。

lijie_suc

回复 干细胞观察 的帖子5 Y# A. w" @* [% z5 K( ]5 q
  B: |/ m" o4 r. S
10%FBS+90%DMEM

小猫狸狸

回复 lijie_suc 的帖子1 |* M! \7 N* `; A8 f3 V
3 G' t; a' b: M! ?% Z
看后面评论复苏用的完全培养基对吧。如果是这样的话，检查有没有水浴时间过长。排除以上两个因素的话，主要原因就出在冻存上了，看看是不是冻存前细胞较密（或者胰酶浓度较低），消化时间较长，造成部分细胞消化过度，同时注意去除胰酶残留。

lijie_suc

回复 lgfffancy 的帖子/ e! ]/ s9 D% W
' Q, c0 @+ ^& {# i3 [
用的是含有10%FBS的培养液。。这样不行吗？

genhaoxin

可能冻存液有问题，我们用5-8%DMSO+FBS冻存，复苏活率几乎100%；复苏时，融化的细胞悬液直接加入到完全培养液中，第二天贴壁后换液。

lgfffancy

冻存液要避光保存