替朋友问一个Western的问题，请指教

katia2004

1.Western的时候，目的蛋白和内参是不是最好从同一块胶上转膜啊！+ c0 a# P! K7 L: V
2.最后western条带好像要用软件扫描条带灰度，三次实验结果的目的蛋白条带灰度除以内参灰度然后再作统计学分析，很多文献里面western图后面的柱形图是不是就是这样绘制的啊！这个图都要求有吗？4 j$ H! e4 ~& L( x/ O1 y4 ~
3.既然上样前都已经等量上样了，为什么还要除以内参灰度进行校正呢？
9 E: L: P/ r- K7 i- ]  c6 h  w/ J我是菜鸟，请高手指点，不胜感激！！！！！6 K( ?2 |" q/ @5 ^. `
顺祝大家实验顺利！！！！

huangzhenbo131

1.目的蛋白和内参从同一块胶上转膜是最好的，除非你的目的蛋白和内参的分子量相差太大，不得已才分开转膜。
3 o, t$ L. Q  W2/3. Western条带一般做灰度统计后就得到后面的柱形图。上样量相等为什么还要做灰度校正呢，那是因为你上样量相等，不一定内参就相等，你测定蛋白浓度时也可能有误差，所以用内参来校正就更准确一些。其实Western只是一个半定量的结果，也就是说只能看到蛋白的变化趋势，假如你的结果可以明显的看到蛋白的变化趋势，那后面的统计结果也可以不要。

nulidaodi

' T, |$ ^! f, L9 ?" E/ q
/ N! n3 `+ u* h+ M" @/ x
我也很想知道这几个问题，呵呵，不过现在还有点疑问想进一步问一下：
6 r- @7 q2 f3 ?* S/ V; b8 U1.目的蛋白和内参能在不同胶上分别跑电泳吗？; a8 s, q: {- o3 S7 F4 H
2.如果因为目的蛋白表达比较弱而需要蛋白上样量比较大，结果内参跑出来因为扩散的比较厉害都连在了一起，这样的问题如何解决呢？
' k1 v" y* a4 P1 K, l4 T3.既然最终都需要内参的灰度来校正，那么当初为什么还要等量上样呢？蛋白直接随便上样最后用内参的灰度值来校正不就行了吗？
2 I1 q) J* s& D( d/ V请楼上高手指点一下，多谢！！！

huangzhenbo131

1.目的蛋白和内参在同一块胶上跑，如果两者的分子量相差较大要分开转膜的话，可以根据Mark的分子量将胶分开，含目的蛋白的胶用来转目的蛋白，含内参的胶用来转内参。) C/ @$ L+ M8 h$ c: t
2. 你可以调高一下电压试试，因为每个泳道的蛋白在电场下除了向前移动外还会有向两边扩散的趋势，调高电压可以增加电场中向前的电场力使蛋白向前走从而对其向两边的扩散起到抑制作用。不过我认为最好的办法还是要减少上样量，这就需要你提高你样品的蛋白浓度，比如说在裂解细胞或组织匀浆的时候少加一些缓冲液。
5 z9 ]) A! V4 R6 }9 _9 K3. 有很多人做Western时，蛋白直接上样，这样也可以，只要你内参之间不要相差太大。等量上样的结果会漂亮一些，发文章的Western图片最好是等量上样。

nulidaodi

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2 h: Y1 S0 R, v3 s7 Y6 C
非常感谢huangzhenbo131战友的回复，还有点问题
8 c. c# k3 {* W- T% J( n$ G6 N1.如果上样的时候不小心样品孔搞混了，比如说作时间梯度的样品，处理15min的样品上样的时候应该上样在处理20min的样品之前，但是不小心两个样品孔搞反了，为了将来出结果的时候好看一些，需要再把这两个条带换过来，有办法吗？通过剪接吗？这样会不会降低可信度啊！
0 v$ v8 J. T- C' X) p2.我有几个蛋白的分子量很接近但又不重叠，用哪种办法来做比较好?用同时加不同一抗孵育的方法还是测完一种蛋白然后strip膜再加第二种一抗的办法检测的啊？
& w, Q$ p/ E7 K$ l3.知道膜可以strip后再利用，如果是用加完一种一抗后然后strip膜再加第二种一抗的办法检测不知道一张膜可以strip几次啊！也就是说一张膜可以反复用来测定几个蛋白啊！问题有点多，麻烦请指点一下，多谢！！！！！！
7 @: i  A, U' s! Z" g) c3 y- W4 N, `  l0 l/ s- ^
顺祝 一切顺利！！！！

饶冠华

[quote]非常感谢huangzhenbo131战友的回复，还有点问题, q$ r1 Q* P$ y- S9 D+ w7 B
1.如果上样的时候不小心样品孔搞混了，比如说作时间梯度的样品，处理15min的样品上样的时候应该上样在处理20min的样品之前，但是不小心两个样品孔搞反了，为了将来出 ...
' T+ v( R. j; H3 u6 Pnulidaodi 发表于 2009-4-27 15:02
9 Y; K/ o$ e) j8 d! E1 T: X. r2 P# V6 p
第一个问题：如果发现样品混了，就重新跑电泳吧，剪辑图像肯定会被认为作假。
  j  G# W" Z: V) [0 t第二个问题：抗体一个一个上，不要同时上，除非你用的抗体专一性非常好（但是也不建议同时上多种一抗）。或者你可以在相同上样量的前提下同时跑好几张膜。' n3 G  X' K# L8 R. q
第三个问题：能少用几次就尽量少用几次。不要偷懒，仅仅是为了节省时间。除非样品很珍贵，比如说IP的样品。我见过一张膜重复利用七八次的，但是一般情况下不推荐。

riance

學習了~~~~

swind

受教受教