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标题:
Car-T操作流程
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作者:
lml0716
时间:
2016-2-2 16:41
标题:
Car-T操作流程
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新版 起草人：lml 编号： SOP-001
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2016年 外周血Car-T细胞培养标准操作流程 页数：1/5
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Car-T细胞培养标准操作流程
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1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。
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2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养
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3责任人：实验员人、临床相关人员
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4 内容
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4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管
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4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。
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4.3环境：
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4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在
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百级生物安全柜内进行。
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4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间
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不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。
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4.4操作：
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4.4.1采集接收外周血
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4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。
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新版 起草人：lml 编号： SOP-001
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4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信
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息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。
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4.4.2操作前准备
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4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安
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全柜运行稳定。
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4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。
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4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。
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4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：
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4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋
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内外周血转入50ml离心管中。
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4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
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4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。
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4.4.3.4配平离心1200g(2100r/min)离心20min，慢升慢降。
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4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处
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新版 起草人：lml 编号： SOP-001
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弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细
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胞悬 液体积比应大于1:3，混匀。
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4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。
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4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。
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4.4.4细胞培养：
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4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞
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培养基PH值7.2-7.4。
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4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中(T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml)。混匀放入CO2培养箱培养2小时。
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4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。
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4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中(100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25)，加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。
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4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。
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新版 起草人：lml 编号： SOP-001
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2016年 外周血Car-T细胞培养标准操作流程 页数：4/5
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4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
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4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
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4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。
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4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。
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4.4.5 Car-T细胞收集：
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4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。
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4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。
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4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。
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4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。
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4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。
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新版 起草人：lml 编号： SOP-001
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2016年 外周血Car-T细胞培养标准操作流程 页数：5/5
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细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。4.5细胞运输与保存：
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4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。
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4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。
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4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。
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4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。
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. e. x" U, o- q5 K/ E
作者:
yooung
时间:
2016-2-2 16:45
谢谢分享！
作者:
我的小宝贝
时间:
2016-2-2 19:03
谢谢分享！
作者:
吕小松
时间:
2016-2-2 21:09
这是car-T么？转染在哪儿？
作者:
biluolinyu
时间:
2016-2-3 13:28
回复
吕小松
的帖子
( g0 J0 \* V( C9 l' w+ d' `
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在 4.4.4.5 里面写的
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次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。
作者:
a276038921
时间:
2016-2-3 15:51
感觉不像啊
作者:
苹果树
时间:
2016-2-3 21:34
为什么没有测转染率呢？怎么知道病毒就转进去了呢
作者:
swtarron
时间:
2016-2-4 14:04
怎么感觉不像啊
作者:
easyess89
时间:
2016-2-9 23:02
我们医院现在做的是DC-CIK，治疗效果个体差异比较大，CAR-T貌似更高级些，它的治疗效果如何？
作者:
ET生物人
时间:
2016-2-16 14:59
不用筛选Tcell？？病毒感染一次就可以？感染率是多少？
作者:
kelinzjf
时间:
2016-2-19 22:51
作者:
kelinzjf
时间:
2016-2-19 22:51
作者:
飞翔的烨
时间:
2016-2-20 08:33
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easyess89
的帖子
* H: s1 ~/ n) c, q1 f5 Z5 `7 v6 s
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哪个单位？
作者:
包公
时间:
2016-2-22 13:41
谢谢，参考了
作者:
大林
时间:
2016-3-15 09:49
非常详细啊~ 这样帖子多点就好了~
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