求助贴 滴度检测

cyberpig

你是感染什麼細胞？如果要感染原代或干細胞的話，一般滴度要比較高。如果是普通細胞株，10^7己經很高了。個人覺得可以考慮以下幾點：# A2 `" k& s4 D; y8 Q/ X. E. |
（1)病毒有沒有保存好：病毒不能存放在四度太久，最好收完離心後立即放到－80度。而且要預先分裝，反覆凍融也會影響效率。* E: z$ c, L1 A* h
（2)感染時培養基的量：一般感染24小時的話，不會擔心蒸發。由於病毒是會浮的，所以用越多培養基會難細胞越遠，所以六孔板最終體積我只會用2ml左右。一般我會試100%病毒培養基或50%病毒培養基／50%新培養基。如果你濃縮了，只要加特定的量到新培養基好了! m, j4 `6 N% y9 C8 y
（3)有沒有用polybrene：可以考慮用5-10 ug/ml（millipore的），可以幫助病毒沉下去。但要注意會不會影響細胞的形態。* x5 j* {2 Y( U' _4 S/ _$ S
（4)如果還是不行，可以用multiple infection。每24小時換一次新的病毒培養基。但要注意有沒有CPE。
2 x& j6 D6 ]9 `) `（5)如果質粒帶selectable marker，就等感染後24小時開始殺，那樣應該能成功。如果沒有，你只能考慮用FACS分選出成功感染的cells。

cyberpig

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" w6 n) n* g$ e4 D  z# k& i
& f5 S/ ]/ W4 c% `& L293T理論上來說應該很容易感染，所以才用來檢測滴度。現在看來有可能是濃縮時病毒的活性受到影響。如果質粒還夠的話建議重新包裝一批，畢竟慢病毒的包裝比較快。如果不想濃縮的話，其實可以考慮收病毒時用的培養基少一點（像正常100cm培養皿用10ml，改用5ml）。一般我會在傍晚轉染，第二天早上換成5ml培養基。第三天早上收36小時後的培養基放4度，再換5ml新的培養基。第四天早上收60小時後的培養基，混合，離心，0.45um過濾和分裝。用這方法包裝的pLKO.1病毒時，我發現沒稀釋的和1:1稀釋的單次感染效率都有80%以上，只差幾％。

cyberpig

回复 maokai345 的帖子  F" S9 L" P$ f5 P  `5 H
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我是用10cm皿做的，如果6孔就每孔用1ml來收病毒（按比例增加減少）。4度最好不要放超過3天。

cyberpig

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$ n/ v) N/ ~* K
  t5 W! z0 [' _- B/ z6 w你是說HEK嗎？如果是HEK的話沒有太大關係吧，因為只要有釋出慢病毒就好。我那時候是不帶瑩光的，所以滴度是做流式來測定的。不過我的確有觀察到HEK會掉下來和cytopathic effect很嚴重（也許因為掉的嚴重我沒留意到細胞的生長），不過我倒覺得這些是high titre的效果啦。