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RNA双螺旋和核酸杂交的发现
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7 C! i, j% ?# X6 X* @4 ~Alexander Varshavsky6 G4 n& X' M& s# w" G, a8 E
# G6 B d. O* N9 q& j7 p+ SCell, Vol. 127, 1295—1297, December 29, 2006
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50年前有关RNA可形成双螺旋的发现，使许多进展成为可能，包括在几十年后发现微RNA和RNA干扰。值得注意的是，在同一篇报道中，也描述了第一个核酸杂交反应。
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今天很难想象50年前我们对活细胞的分子基础的了解是多么匮乏。在1953年Watson和Crick的Nature文章中描述的双螺旋结构，是对既含有遗传信息，又能进行复制的分子结构的深刻洞察。然而，另一种核酸—RNA—的作用并未确定。那时许多人相信RNA参与蛋白质合成，但那只是基于间接推论的一种臆测。由于RNA有一个额外的羟基，因此与线形DNA不一样，它理论上可以分枝。1953年Watson-Crick的文章在关于DNA双螺旋提到：“也许不能用核糖来代替脱氧核糖建造这种结构，因为多余的氧原子可能形成过于紧密的范德华接触。”这是否意味着RNA不能形成任何双螺旋？果真如此的话，如果RNA病毒不能以与DNA相同的方式形成双螺旋，它们如何复制（那时有人正在研究RNA病毒）？' ^: p0 B% B% x0 N
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1953年下半年Alexander Rich在加州理工，是Linus Pauling的博士后，而James Watson是Max Delbruch的博士后。Rich和Watson都对RNA是否可形成双螺旋感兴趣。他们相继进行RNA纤维的X射线研究，使用在DNA研究中获得成功的技术。这项研究工作产生了两篇论文。Rich和Watson在这两篇论文中分析了RNA纤维的X射线衍射图。他们看到的衍射构型对于确切描述RNA基本结构来说过于分散。与DNA样品中的腺嘌呤与胸腺嘧啶、鸟嘌呤与胞嘧啶1：1的比例很不一样、有很大不同碱基比例的RNA，也产生令人不解的相同衍射构型。20世纪50年代早期鉴定的若干RNA病毒似乎缺少在DNA中所特有的碱基比例。RNA纤维是负双折射的（这也是DNA纤维的特征），说明在RNA中碱基常常处于纤维轴的垂直方向。除此之外，推论不出更多的信息。9 f) `8 z: u# D( W/ R$ V# [. o/ C
/ T& Q6 F; T2 ]2 E 1954年Rich转到国立卫生研究院(NIH)，建立了物理化学分部。David Davies不久也加入了Rich的实验室。1955年一个重要事件是在Severo Ochoa的实验室发现了多核苷酸磷酸化酶。这种依赖于模板的酶能够将核糖核苷二磷酸转换成RNA多聚物。Rich和Davies开始使用这项技术合成RNA，研究合成的RNA纤维的衍射构型。他们发现含有腺嘌呤和尿嘧啶残基的随机序列共聚物产生的衍射构型与在天然RNA中发现的衍射构型非常类似。这些合成的RNA链明显是线性的，说明天然RNA分子不大会含有分枝。
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& V6 I! A+ E& u2 w: C3 }/ ~ 在1956年春天，Rich和Davies发现聚腺苷酸(polyA)和聚尿苷酸(polyU)的钠盐混合时，有“非常迅速的黏度增加以及在260 nm光密度的下降”。在纽约大学Ochoa实验室的Robert Warner也在相同时间报道了光密度下降。Rich和Davies的报道称，从polyA和polyU的黏溶液中，可抽提出粗硬的负双折射纤维。这种纤维产生“一种有良好方向性的X衍射，其密度分布具有螺旋特征”。这种衍射构型与DNA的衍射有很多相同之处，但在第一层线中有很大不同，这层衍射线在RNA中很强，但在DNA中很弱。RNA分子的计算直径为26 A比DNA纤维的20 A要大许多。Rich和Davies在《美国化学学会学报》(JACS)发表的一篇短文中称：“这些结果第一次表明RNA骨架可能与DNA骨架类似，使用相同的碱基互补性。这表明可能存在着与DNA类似的RNA分子形式，在植物和动物小病毒中，RNA以这种形式进行复制。”在溶液中，polyA和polyU之间通过一种重要的反应形成RNA双螺旋。Rich和Davies又补充道：“我们在此指出，对于旨在利用特定反应去理解螺旋分子形成的研究，可使用通过简单混合两种物质形成双螺旋分子的方法。”在将短文送交JACS两星期后，从Rich写给Linus Pauling的一封信中可看出他对这项发现的惊讶。这封信传递了这样一种诧异：这种反应可以天然发生，并“完全可重复”。第一个杂交反应就是这样发现的，它引起人们的极大怀疑。, l! m, K9 T. V0 H8 C
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Gary Felsenfeld随后加入了NIH实验室，继续对这两种RNA 多聚物混合物的反应进行系统研究。通过仔细测定紫外光密度，可以清楚表明两条链形成1：1的结构，其腺嘌呤和尿嘧啶有相等摩尔含量。
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0 H% m# F% O8 D& ?4 v% @9 e% V Felsenfeld, Davies和Rich报道了加入少量镁离子可以将双链RNA分子转换成三链分子，含有第三条聚尿苷酸链。第三条链没有增大螺旋的直径。Felsenfeld等的解释是，加入的尿嘧啶与腺嘌呤配对。两年后，K. Hoogstein在他有关1-甲基胸腺嘧啶和9-甲基腺嘌呤复合物的单晶分析中看到这种结合方式。三链RNA分子的形成第一次表明RNA可以有较大的结构复杂性，这仍然是现代RNA结构分析中的课题。
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6 L0 }5 c9 t9 n* N# | @! E 1962年之前对RNA双链衍射构型分析的进展，使人们认识到RNA双链与（脱水的）A型DNA非常类似。然而，RNA结构仍不能确定，这是因为纤维衍射远达不到产生足够数据，使每个原子得到定位的地步。这方面的进展只有通过单晶的X射线晶体图才能取得。Rich及其同事继续研究RNA结构。他们在1973年发表了第一个RNA双螺旋的单晶结构。他们以0.8 A分辨率解析了GpC和ApU的结构，揭示了RNA双螺旋的全部细节。在同期Nature的“新闻和观点”专栏的文章中给出的评论是，ApU结构是核酸结构的“缺失环节”，这个环节解答了许多有关Watson-Crick碱基配对和双螺旋结构的问题。这些研究是在可以使用合成的寡核苷酸进行单晶X射线衍射研究之前几年进行的。
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今天我们知道双螺旋的RNA在生物学中有若干重要作用，它是许多分子（包括tRNA和核酶）的结构框架。双螺旋RNA是许多系统中核酸复制的基础，这种复制完全是DNA复制的类似物。最近RNA双螺旋已成为重要的RNA干扰(RNAi)现象和以RNA为基础的循环的关键因素。RNA双螺旋遍及所有现代生物学。它也与医学有关，因为可能会出现基于RNAi的药物。
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核酸杂交
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3 g" K+ [. m" U+ j 在20世纪50年代许多人认为长聚合分子在溶液中自发形成双螺旋是不可思议的，因而对核酸杂交产生了诧异和怀疑（在启始阶段）。许多人认为没有酶的帮助，不大可能发生长链核酸杂交（尽管这些怀疑论者的看法对体外状况是错误的，但对体内状况是正确的。在拥挤的细胞环境中，非专一性聚集是一个主要问题。如在几年后发现的那样，RNA和DNA双链的形成和解离，确实是由特定的酶来决定）。有一些化学家认为由于熵的影响，不大可能使有几千残基的缠绕大分子在溶液中形成线状双螺旋阵列。理论家指出，两条高负电荷的多核苷酸链，不大可能聚集在一起。这些批评只能随着时间和对稳定双螺旋结构的力的深入理解而减少。上述进展最终被认为是核酸化学的重要改变。
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1956年以后，对可以形成其他螺旋复合物的杂交反应进行了大量研究。在20世纪50年代后期的一个重要问题是RNA和DNA是否可形成一个杂合双螺旋，以此作为从DNA向RNA传递信息的基础。当时一般认为“从DNA产生RNA，从RNA产生蛋白质”，但没有DNA可与RNA结合的证据。在20世纪50年代后期开始研究在粗生化制备物中的依赖于DNA的RNA聚合酶活性，但是由于样品纯度不够，不能直接证实依赖于DNA的RNA合成。
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很早人们就已经知道RNA双链的几何学细节不同于DNA双链。例如，与DNA不一样，在纤维中的RNA构象不随着湿度降低而改变。总而言之，那时不能肯定DNA和RNA是否能形成杂交螺旋。1960年Rich使用短的（化学合成的）多聚脱氧胸腺核苷酸和多聚核糖腺苷酸，进行了第一次DNA—RNA杂交。他发现这两种多聚核苷酸形成了一个杂合的双螺旋。这种DNA—RNA杂交在今天得到广泛应用，例如，通过mRNA的polyA尾与固定的poly-dT杂交来分离mRNA。Rich在1960年报道的结果使从DNA到RNA的信息传递机制包含有DNA—RNA双链成为可能（至少是过度性的）。0 k) u. H7 J1 u; B! ~
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杂交深入发展过程中的关键一步是使用非同聚物的、有特定（非随机）序列的核酸。Paul Doty在1960年以及Julius Marmur在这之后不久，都进行了DNA—RNA相互作用的研究。他们的分析表明，刚好低于双链熔解温度的变性DNA链能够重新排列，找到彼此，重新形成双螺旋，因而能恢复DNA的生物活性（转化）。一年后Ben Hall以及其后的Sol Spiegelman将DNA—RNA多聚物杂交与Marmur—Doty退火步骤结合起来。通过这种方法证实在噬菌体T2 DNA和T2感染的细菌中的噬菌体编码的RNA之间可形成一个特定的杂交体。在1961年之前，所有的“第一代”杂交方法都处于可进一步拓展的状态，这种方法进一步成为现代分子生物学的基础。/ A& F5 }! f, Z* q0 |! n$ L
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Southern印迹法是Edward Southern在1975年开发的，它将核酸杂交与限制性内切酶的使用、凝胶电泳、分离的DNA向固体支撑物的转移相结合。这种方法以及其后的替代方法（大规模平行物），即所谓的微阵列，对生物学研究仍然十分重要。在20世纪80年代，杂交是聚合酶链反应(PCR)的核心，它通过在体外迅速和精确地扩增核酸序列，为分子生物学研究带来了革命。总而言之，分子生物学中的许多重要进展，或直接或间接使用核酸杂交作为其技术核心。几个最近的例子是，在染色体涂布中的杂交，人类基因组序列分析，以及用于法学的DNA分析。6 d- R, Q) z% t% r
1 ?: Z1 ]& _6 R) D/ Q% X3 J* X 值得注意的是，第一个RNA双螺旋和第一个核酸杂交的发现来自50年前的同一篇文章。
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% \* C E) }1 ~. l1 `& S0 e本文转自建人先生原创，感谢 |
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发表于 2009-4-28 21:14
发表于 2015-6-18 18:25
