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动物发育中的微RNA
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Ronald H.A. Plasterk6 H% _! q5 e4 ?
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Cell Vol. 124, 877-881, March 10, 2006
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0 k- F3 h% w3 t 微RNA(miRNA)是22核苷酸单链非编码RNA分子，与靶信使RNA(mRNA)结合并使其沉默。本文探讨了miRNA在动物发育中的重要性以及miRNA在疾病和进化中可能扮演的角色。
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从线虫开始
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10多年前在线虫Caenorhabditis elegants幼虫突变体中发现了微RNA(miRNA)，并发现它们调节基因表达。具有lin-4基因突变的蠕虫幼虫在细胞分裂的时间上发生错误。Lin-4基因为与lin-14 mRNA结合并使其表达沉默的一个小RNA编码。第二种小RNA是let-7，它在蠕虫、果蝇和人中高度保守，这表明这些新基因调节子普遍存在。目前估计动物基因组至少含有500个为miRNA编码的基因，有几千个基因是miRNA反应的靶标。6 i, N3 p/ }' f+ Y8 E% u Z- x* Y
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在动物细胞中有两种酶（细胞核中的Drosha和细胞质中的Dicer）对较长的原或前miRNA加工成长度为~22核苷酸的成熟miRNA很重要。Dicer是miRNA产生所必需的，缺少Dicer的动物不能合成miRNA。在miRNA中有一个7核苷酸种子序列（5’端2-8位）可能对miRNA在动物细胞中的反应很重要，其他位置的核苷酸对miRNA反应的作用较小，但也有重要影响（对其保守性有影响）。成熟miRNA与其靶mRNA的结合在称为RISC(RNA诱导的沉默复合物)的蛋白复合物中发生，RISC至少含有一个Argonature蛋白质家族成员。miRNA与其靶mRNA 3’端非翻译区（3’ UTR）的互补序列结合，使该mRNA的表达沉默。! v: L) H! Y& Y3 D2 S+ P3 `8 C
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miRNA怎样工作？
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miRNA使其靶mRNA沉默的确切机制仍不清楚。在第一个发现的蠕虫miRNA lin-4的情况中，其靶mRNA lin-14保持完整，稳态水平保持不变。由此推测lin-4 miRNA使lin-14 mRNA沉默，但无降解发生。然而，miRNA引起的基因沉默往往伴随有靶mRNA水平下降，尽管这种下降通常不大，不足以解释其后蛋白质水平的下降。第二个需要澄清的要点是，是否miRNA抑制翻译的起始和延长步骤。最近的研究表明将IRES（核糖体进入的内部位点）引入核糖体可以抵消miRNA对翻译的抑制，这说明miRNA在翻译起始步骤起作用。
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7 B6 S$ S' P- t: a# r/ jmiRNA反应中的冗余
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在果蝇或线虫的正向遗传筛选中不能找到miRNA突变体，部分原因是miRNA作为突变的靶子太小了。微RNA对单核苷酸变化有耐受性，条件是这种变化不影响7核苷酸种子序列。此外，研究人员对基因的蛋白质编码区域的突变进行定位时往往忽略非编码的miRNA序列的突变。然而，对为什么在果蝇和线虫的突变体筛选中找不到miRNA突变体的最确切的解释是为miRNA编码的单个基因的缺失不产生表型。要获得表型，必须删除多个miRNA基因。在使用吗啉代对斑马鱼胚胎的miRNA进行敲除时可观察到这种情况。在细胞中存在极高水平的miRNA（通常大于50000拷贝）是由于有为miRNA编码的大量相关基因，一个基因的丢失对miRNA表达的减少影响不大，不产生表型。由此产生的问题是，如果选择压力如此之小，为什么有这么多高度保守的miRNA。 o! F9 |% |6 n# S! i6 r) V3 S
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许多miRNA有组织专一性
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% P( R, R1 {2 a l miRNA的组织专一性表达谱为其潜在功能提供了一些线索。许多miRNA显示了很强的器官专一性表达，其表达可局限在某个器官的单一组织层。因此miRNA可能与持家过程（如细胞代谢）无关，而是在某些方面对增加分化细胞的差异很重要。第二个有关miRNA功能的线索来自在斑马鱼中破坏Dicer基因，使miRNA全部丧失。缺少Dicer的小鼠在胚胎发育的早期死亡（胚胎干细胞的形成需要Dicer，因此无法用缺少Dicer的小鼠胚胎进行进一步的研究）。但在斑马鱼中可以使Dicer基因为杂合子的两条鱼交配，对纯合子后代进行分析。这些纯合子在一星期后停止生长和死亡，在这之前它们发育正常。在完全缺失Dicer时，这些胚胎中Dicer基因缺失的纯合子在发育72小时之前形成大部分器官，可以泳动、进食，其行为与正常鱼相似。对miRNA水平分析揭示了上述观察可部分用母体Dicer（卵母细胞含有母体Dicer mRNA和蛋白质）的救援来解释。在胚胎发育的最初几天，没有合子Dicer的胚胎可以形成新miRNA，这是由于存在母体Dicer的活性。从在这些斑马鱼胚胎中miRNA表达的瞬时图谱中可明显看到miRNA在许多细胞分化和组织形成之后才产生。miRNA的缓慢增加可能反映了它们随时间的累积。许多miRNA基因位于蛋白质编码基因的内含子中，与其“寄主”mRNA共同转录。也许是由于miRNA的转换较慢，其水平随时间增高，而“寄主”mRNA水平不变。有一系列精细的实验清晰表明miRNA在斑马鱼的早期发育中不是很关键。将有突变Dicer的斑马鱼胚胎的生殖细胞移植到相同年龄的野生型胚胎中，可以使Dicer的母体表达停止。这些斑马鱼长大后可生育，但其生殖细胞是Dicer突变纯合子。由于没有母体Dicer，这些斑马鱼的后代在发育的早期便停止生长。但即使在这种情况中，这些斑马鱼的后代也可形成几种组织。由此可知尽管斑马鱼的完全发育需要miRNA，其表达谱也清楚表明miRNA在发育中起作用，但是这些动物组织分化的起始并不需要miRNA。
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" o( z4 L6 o, u/ {5 I9 w' d; j' c作为发育开关的miRNA
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9 c" ? y& n0 I 最近的一些研究描述了miRNA如何在发育中调节基因表达。例如在一项研究中表明miR-61通过反馈环决定蠕虫发育中第二裂口细胞的演化。裂口细胞演化由两个基因的互斥表达来决定。一个基因的表达引起初级裂口细胞演化，第二个基因表达产生第二裂口细胞演化。两个交互稳定状态的存在是由于第一个基因编码的蛋白质启动一个miRNA的表达，这个miRNA减少第二个基因的表达。在另一项研究中描述了miR-196如何在几个Hox基因（发育的关键调节子）的上游反应。另外有一组miRNA调节Notch信号级联，该信号途径在动物发育中很重要。在上述各种情况中，miRNA的反应在发育中起整合作用。因此miRNA反应可能处于正进化压力之下。上述研究以及另外的研究发现了在相关种属中miRNA靶位点的进化保守性，能令人识别在基因3’UTR中的miRNA靶位点。
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& S7 b* d/ P- n6 a, e } v miRNA作为发育开关的前提是miRNA及其靶mRNA在相同组织中表达，这样miRNA可以进行反应，使其靶mRNA的表达沉默。直觉上如果某个mRNA是一个miRNA的“真正靶标”，二者必须共同表达。为了找出生物学上相关的一对miRNA-mRNA，最初的步骤是用每个miRNA的关键7核苷酸种子序列对所有已知基因的3’UTR序列进行筛选。再通过只保留在相同组织中表达的miRNA-mRNA对对筛选得到的miRNA-mRNA对进行过滤。但最近关于蝇类和哺乳动物的两类研究表明上述步骤会产生错误。
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1 k# F+ _9 f k, v" s* ^* B4 c! W& ]3 v; N避免伙伴关系
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: O, U# g2 | d `8 b1 Z6 v 这两类研究得出基本上相同的结论。如果用已知在某种类型组织（如肌肉）中表达的miRNA，去检测3’UTR含有某种miRNA潜在靶位点（与7核苷酸种子序列完全匹配）的基因的表达，可以发现在缺少miRNA的组织中，带有靶位点的基因的表达要高于它们在含有miRNA的组织中的表达。因此真正的伙伴（miRNA加上其mRNA靶标）不一定共同表达。3 \8 G* {( _5 s2 v
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因为miRNA可以降低转录水平，所以原因和结果的关系不是很清楚。低mRNA水平是miRNA反应的结果？或基因在其mRNA可能遇到伙伴miRNA的组织中“避免”转录？Farh及其同事通过分析缺少小鼠miRNA靶位点，但有人直向同源miRNA靶位点的小鼠基因很好地解决了上述问题。这些小鼠基因在表达miRNA的组织中似乎不表达。这表明表达的缺失发生在转录水平，而不是miRNA反应的结果（因为该基因的小鼠版本在该组织中不受miRNA反应的影响）。- h; [8 X/ g% j" r& i) K9 l
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上述两篇文章也发现了“抗靶”的证据，即在有miRNA表达的组织中高水平表达的基因没有miRNA可以结合的序列。由于miRNA减少基因表达，基因获得新的miRNA靶位点（这在进化中并非罕见，因为关键种子序列仅有7核苷酸长）并不是好事，如果产生不需要的基因沉默，进化会选择除去miRNA靶位点。
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请注意这里使用的术语可能会引起混淆：对外部观察者来说，这些数据表明有miRNA靶序列的基因避免在表达miRNA的组织中表达。但事实上是以另一种方式起作用：在表达miRNA的组织中高效表达的基因不能承受含有该miRNA的靶位点，因而有一种选择机制避免获得该位点。在组织中不表达的基因不受这种选择压力的影响，在该组织中可以自由接受miRNA的新靶位点。全部转录表达谱的统计学分析结果表明含有miRNA靶序列的基因似乎避免在表达特定miRNA的组织中表达。( n" h }, R, @6 u9 {+ `
F" [0 ]; ^5 P W程序化和非程序化的miRNA—靶标相互作用' F) h) o* D& F
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程序化的miRNA反应（如在发育中的反应）怎样与避免共同表达相关联？Farh等的研究中所作的区分为这个问题提供了答案。miRNA的靶序列可分为两类：保守的和非保守的（用小鼠基因3’UTR与其他哺乳动物直向同源基因比较来定义靶位点是不是保守的）。大部分miRNA靶不是保守的。Farh及其同事证实非保守位点主要存在于不与其miRNA共同表达的基因中。相反，保守靶位点主要存在于与其miRNA共同表达的基因中，尽管这些保守靶位点在没有miRNA的组织中表达水平更高。
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某些miRNA靶位点的保守性可能是由于某些miRNA的作用是发育开关。第二类miRNA靶位点可能存在于只需要在发育的某一阶段进行表达的基因中。在细胞演化决定后，miRNA使组织中不再需要的靶mRNA的表达消除。在第三类程序化的沉默中，miRNA系统可能用来减少而不是完全停止靶mRNA的表达。根据许多miRNA表达的晚期启动和保持，以及鱼胚胎组织中全部miRNA缺失的观察，可以看出许多miRNA可能并不是细胞演化开关，而是削弱不必要基因的表达，使细胞处于所选择的演化过程。
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对非保守miRNA靶位点可能有完全不同的解释，基因的3’UTR是miRNA可以结合的全部序列。3’UTR有一或二千个碱基，miRNA有几百种，因此与miRNA 7核苷酸种子序列可有许多匹配。在进化中这种新”miRNA”靶序列不断出现，它们本身没有什么问题。但如果在组织中需要表达的基因存在靶位点，并同时存在高水平的miRNA，可以使与之匹配的mRNA沉默，这时会出现问题。对于这些基因来说，与miRNA匹配是有害的，从而导致不相适应，对这种匹配进行反向选择。可由此解释Stark等研究中的观察：在所有细胞中表达的持家基因有较短的3’UTR序列，这可能是为了避免miRNA对基因表达的抑制。只要可以与这些新出现的miRNA靶序列结合的miRNA不在相同组织中表达，这些靶序列（没有功能，也没有使其保持保守的选择压力）在选择中的影响可能只是中性的。也许对于生物来说这些新出现的miRNA靶序列如同在细菌DNA中的EcoRI位点（GAATTC），只要EcoRI不存在于细菌中就无须关注。( T" ?* @3 i0 L4 c; X D5 r& g% E3 z
" |; J* ]# s/ ]) E7 ~. q3 C三类miRNA-mRNA对
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8 m, z+ i- M1 K3 _0 ^ o7 I% a miRNA与其mRNA靶标的结合可分为三组：编程（正选择）、中性和抗靶（负选择）。
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在第一组miRNA与mRNA的结合中，正选择或编程相互作用在发育中是细胞演化的真正开关。例如，在蠕虫发育中，miR61决定第二裂口细胞演化。另一个例子是在较早的发育阶段对细胞演化决定发挥了作用的mRNA，它们的表达需要减少或受到限制。这种相互作用应该是保守的，因为它们对建立或保持细胞演化的贡献是正面的。
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第二类miRNA-mRNA结合可能是中性的。对这些中性结合对可以有两种解释。第一种解释不大重要：miRNA及其靶标不在相同组织中表达。如果一个基因只在肠上皮细胞中表达，该基因中存在肌肉miRNA的靶位点则无关紧要。对于尝试用对基因组的miRNA匹配找出miRNA靶序列的生物信息学家，这种中性结合是噩耗，但是对生物本身没有什么影响。第二种解释是miRNA及其靶mRNA确实在细胞中相互作用，但这种相互作用的影响在进化上是中性的。相关基因的表达可能会减少，但是对生物没有影响。需要注意的是，这种相互作用在进化意义上是中性的（无选择影响），但在生物化学意义上并非如此，因为miRNA可以起负调节作用（删除这些miRNA可导致靶基因表达的增加）。这类虽然是中性但很活跃的miRNA-mRNA结合对数量很大。尽管第一类结合（编程相互作用）在种属中保守，但中性结合没有保守性。1 M6 A$ }" m4 I
6 C. ]# w6 Z, G7 T) F 在第三类miRNA—靶mRNA相互作用中，miRNA与靶mRNA在相同组织中表达，关闭细胞要表达的基因。这种现象可被避免的程度说明对这种共表达有选择压力。确实，这种miRNA的mRNA靶被称为抗靶。在抗靶基因中的靶位点必须处于稳态水平，因为新的靶位点不断出现，并最终被选择压力过滤掉。" X9 u: V _ f/ R- _
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疾病中的miRNA靶标& a* n, S L% B1 P# R
( ~" Q; N& `1 ~1 Q m7 M 根据上述miRNA-mRNA相互作用的不同，这些相互作用的突变可通过四种方式引起疾病（有些疾病还没有观察到）。7 v. y0 U: g: L+ J: [0 R/ d
0 P O4 T, x* O" Y4 q; U$ ?, h0 n （1） miRNA可能有导致其功能丧失的突变。尽管在miRNA中有某种程度的冗余，但这只是在总体水平上（可在实验室观察到）。即使丢失一个miRNA也可能对发病有微妙影响。
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# m0 E- ?* O! ^) E% M （2） 在miRNA中可能有获得功能突变。通过miRNA基因扩增进行超量表达可能与原癌基因的超量表达类似，引起癌症。
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（3） 程序化的靶位点可能获得某种突变，使其不能与miRNA结合，造成该miRNA调节的基因得以释放。
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（4） 某个基因可能会得到新的不需要的miRNA靶序列，导致基因不正常沉默。许多序列只需要再有一个突变，便可以成为在相同组织中表达的大量miRNA之一的靶标。这些突变可能引起基因活性不适当的减少，因而引起疾病。最近Abelson等报道在为轴突警戒分子SLITRK1编码的基因中，miRNA靶位点的产生与神经疾病图雷特综合症的产生有关。
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miRNA-mRNA相互作用是否在种形成中起作用？6 p7 S! q3 N. h- D, k
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因为许多miRNA对基因调节有复杂和综合的影响，每一种miRNA有其微妙影响，所以miRNA靶序列的多态性是在发育中产生微小变化的理想物质，在进化中可对这些微小变化进行自然选择。在基因的蛋白质编码序列中的变化或者完全破坏蛋白质功能（对进化选择没有正面影响），或者对蛋白质没有改变，或者减少其活性。另一方面，在miRNA靶序列中的变化可使基因表达谱更恰当。可以认为通过得到或丧失miRNA靶序列进行基因表达的精细调节与进化有关。这种假设可以通过基因组序列比较和其他的实验进行验证。也许在鱼和人中同源器官发育的不同基本上可通过主要发育基因3’UTR中miRNA靶位点的不同进行解释。对动物细胞中miRNA及其靶mRNA的深入研究一定会为在发育、疾病和进化中miRNA的重要性提供更新的证据。0 ?: J1 D/ o6 a: R: P: O
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本文转自建人先生原创，感谢 |
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发表于 2009-4-28 21:19
发表于 2009-11-15 02:49
