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分子生物学精选（内源siRNA） c) N8 r# }% J# b8 e$ F) M
$ m4 x8 ?1 c2 q/ E% g# jFabiola Rivas
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Cell 133, 747 – 749, May 30, 2008* A" C# p1 ^8 _* p
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; j( s( w. x" L* J; \ 在RNA干扰(RNAi)途径中最早鉴定的活性之一是siRNA介导的对靶转录产物的核苷酸内切，也被称为Argonaute蛋白的“切割器”功能。之后的研究表明，在果蝇和哺乳动物中，这种活性是由Argonaute2 (Ago2)介导的，它对果蝇中RNAi对外源双链(ds) RNA（如在病毒感染中产生的dsRNA）的响应非常重要。Ago2在内源基因的调节中是否也有重要作用，内源siRNA是否确实存在于果蝇和哺乳动物中，它们有什么功能，这些问题尚无定论。目前有一系列新研究报道了内源siRNA存在于果蝇的生殖细胞和体细胞中以及存在于小鼠的卵母细胞中，这为了解siRNA这类小RNA的生物功能提供了重要信息。另外两项有关小鼠的研究进一步揭示了假基因通过RNAi途径在基因调节中所起的作用，并为保守的Ago2催化活性的进化压力提供了重要信息。/ [" s( |. _) {
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来自内部的siRNA. ^8 ~' z! M! R; Y1 b, e% f$ V
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Argonaute蛋白是RNAi机制的必需组分，它们与不同的小RNA结合，使其发挥效应子作用。Argonaute家族的一个分支是PIWI亚家族，它们与作用于Piwi的RNA (piRNA)形成复合物，是限制生殖细胞中转座子活性所必需的。Argonaute蛋白与小干扰RNA (siRNA)或微RNA (miRNA)结合，通过siRNA指导的靶mRNA转录产物的切割，或通过miRNA介导的转录后抑制（包括翻译抑制和mRNA降解），使基因表达沉默。
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果蝇中有三种PIWI蛋白和两种Argonaute蛋白 (AGO1和AGO2)。遗传和生化证据证实果蝇的AGO蛋白有功能专一性，包括AGO1与miRNA结合，AGO2参与siRNA介导的基因沉默。功能专一性也存在于与这些小RNA有关的生物合成途径。miRNA的加工包括内切酶RNase III Drosha和Dicer1 (Dcr-1)以及结合分子Loqs对RNA内源发夹前体的切割。与AGO2结合的siRNA由Dicer2 (Dcr-2)及其结合蛋白R2D2对长链dsRNA加工形成，但不久前还只有关于果蝇和哺乳动物的siRNA由外源长链dsRNA形成的报道。现在有一组新发表的文章报道从果蝇的体细胞和性腺细胞中分离到内源siRNA (endo-siRNA)，提供了有关这些siRNA的生物功能的信息。有趣的是，内源siRNA在基因组保护和基因调节中都很重要，因此使piRNA和miRNA的功能得以衔接。由于在外源siRNA和miRNA的生物合成中有一些共同因子，这使我们目前有关果蝇小RNA的生物合成的概念更为复杂。3 ]2 P/ {; z O; z1 \/ \; U
- |* }, s1 A. B$ P+ j1 o: t5 f结构与功能
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通过结合使用生物化学和深度序列分析方法，三个研究小组制备了果蝇细胞系或完整组织（卵巢或头）的总小RNA库或在AGO2免疫沉淀物中富集的小RNA库。Okamura等使用计算方法，寻找可作为长链dsRNA来源的果蝇基因组中潜在的长反向重复转录产物，并进一步分析通过深度序列分析使小RNA得以定位的基因组区域。这些研究共同揭示了存在一类比miRNA略小的小RNA（长度为21核苷酸，而miRNA的平均长度为22核苷酸），它们具有siRNA的特性，即5’端单磷酸，3’端有2’-O-甲基化。内源siRNA显然是从3个主要基因组区域产生的：（1）转座子和其他基因组重复区域；（2）可直接形成长链dsRNA的区域（称为结构化基因）；（3）交汇转录区域。内源siRNA的一部分很明显是从以前已证实的piRNA的主要产生区域产生，由此证明这些作为进行转座子控制的小RNA的来源的区域有双重功能。尽管功能类似，但内源siRNA明显不同于piRNA。例如，piRNA偏爱反义，而以转座子为标靶的内源siRNA则没有这种偏爱。测定内源siRNA是否在特定位置有核苷酸专一性以及比较这种专一性与miRNA和piRNA的特性有什么不同，是非常重要的。% N! a) l9 ^6 e" {$ c! q6 Z* d
Q" V. B& B* \ 对内源siRNA功能的分析表明内源siRNA使miRNA和piRNA的某些正常活性（基因调节和转座子控制）得以衔接。尽管通过内源siRNA进行的基因调节的生物学作用还不很清楚，但在ago2和dcr-2基因突变的果蝇中，作为小RNA标靶的基因的表达有所增加，这表明存在功能相关性。很大一部分内源siRNA完全与转座子互补，在缺少AGO2和Dcr-1的体细胞组织和果蝇卵巢中已观察到一组转座子基因的表达有所增加，这表明内源siRNA对控制果蝇体细胞和生殖细胞组织中的转座子很重要。从交汇转录产生的小RNA与酵母转录终止有关，检测它们在果蝇中是否有相同作用也很有趣。这些研究的一个重要发现是鉴定了与ago2互补的siRNA，这表明在内源siRNA途径中存在自我调节环路。
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生物合成1 i( q% j) n( [# y1 I
; r, g: f8 `0 N" s$ N 这些研究也提供了果蝇内源siRNA生物合成途径的初步信息。有趣的是，内源siRNA的生物合成很明显使包括了AGO1、Dcr-1和Loqs的基本miRNA生物合成途径，与包括了AGO2、Dcr-1/R2D2和甲基转移酶Hen1的外源siRNA生物合成途径之间的区别变得模糊。事实是内源siRNA的产生依赖于AGO2和Dcr-1，但与之矛盾的是也要有Loqs的参与。Loqs的缺失对从结构化基因产生的内源siRNA的影响最大。从结构化基因产生的内源siRNA明显过多地存在于AGO1的免疫沉淀物中，这表明不同的内源siRNA有不同的生物合成和成熟机制。最后，果蝇和哺乳动物的内源siRNA和piRNA从相同基因组区域产生使人产生了这两种小RNA的生物合成是否在某种程度上偶联的疑问。5 `. U+ u. `. {( k2 I& n" ~& U
" D. F5 z7 v" Y# _. Y9 yM. Ghildiyal et al (2008). Science. Published online April 10, 2008. 10.1126/science. 1157396- L. N4 m$ h* Z0 ?7 p3 O e& n
+ J2 N2 o7 \# o% k/ pB. Czech et al(2008). Nature. Published online May 7, 2008. 10.1038/nature 07007" Z( L( u& A% A6 q. i; C9 V o
- Z; k3 f! u$ D r/ j1 o: ]0 mY. Kawamura et al(2008). Nature. Published online May 7, 2008. 10.1038/nature 06938' T" H) {1 A) E a
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K. Okamura et al(2008). Nature. Published online May 7, 2008. 10.1038/nature 07015
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( a/ ]* e% T# K% p' E假基因走向前台中央6 O& P* ?% h0 N; V/ b
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Tam等和Watanabe等在两项相关研究中回答了在哺乳动物中是否存在内源siRNA的问题。在小鼠中，任何PIWI家族成员的删除都会导致发生以丢失生殖细胞为特征的雄性不育。这种生殖细胞丢失与转座子活化有相关性，而转座子一般是受生殖细胞piRNA的抑制。与之矛盾的是，尽管对雌性和雄性生殖细胞来说，防止转座子过度活化都很重要，但有同源Piwi基因删除的雌性小鼠表型正常，可以生育。Tam等研究了是否有类似于piRNA的另一种小RNA途径在卵母细胞中起作用。Watanbe等先前曾报道过小鼠卵母细胞中存在的内源siRNA，但鉴定的siRNA数目很少，因此这些小RNA的相关功能还是一个悬而未决的问题。Tam和Watanbe的研究小组使用了类似的方法，通过深度序列分析对小鼠卵母细胞的小RNA库进行分析。和预期的一样，从不同的基因组基因产生的piRNA占了得到序列分析的卵母细胞小RNA的大部分，这说明Piwi途径在雌性生殖细胞的转座子控制中有保守的功能。然而，对该小RNA库的分析也揭示了存在一类长度为21核苷酸的小RNA，它们主要位于逆转录转座子和基因组的结构化基因上。这些内源siRNA的产生取决于Dicer，与这些内源siRNA在转座子控制中的作用相关的是，缺失Dicer的卵母细胞可表达更多的转座子。重要的是，在雄性生殖细胞中没有检测到内源siRNA，这可为携带Piwi家族成员突变的雄性和雌性小鼠的不同提供一种解释。
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上述研究人员的发现还有一个很重要的方面，即在卵母细胞中，可通过为蛋白质编码的有义转录产物与假基因的反义转录产物配对所形成的dsRNA，产生内源siRNA。他们鉴定了完全是从假基因转录产物和基因转录产物之间的重叠区产生的siRNA，其中一些siRNA与其潜在靶转录产物完全互补，这说明有一个Ago2介导的切割机制。在Dicer缺失细胞中以及在Ago2敲除的卵母细胞中，这些内源siRNA的靶转录产物的丰度有所增加，说明内源siRNA对转录产物水平的调节在生理上很重要。概括说来，上述研究表明假基因通过RNAi机制在其“源基因”（假基因从该基因形成）的调节中起作用。先前人们只在有依赖于RNA的RNA聚合酶(RdPP)活性的生物（如植物和蠕虫）中发现有内源siRNA，这些新研究表明有调节作用的内源siRNA也存在于缺少RdPP活性的果蝇和小鼠等生物中。下一步是研究在其他生物中内源siRNA是否存在及其潜在功能。另外，至今小鼠中的内源siRNA只限于卵母细胞，确认这一点非常重要。如果确实如此，这种组织专一性表达是怎样调节的？最后，这些内源siRNA在Ago2免疫沉淀物中得到富集，说明它们很可能是通过靶转录产物的切割器切割发挥作用。在哺乳动物中，在进化中只保留了一种Argonaute蛋白(Ago2)的切割器活性。内源siRNA的发现可用来解释只保持一种Argonaute蛋白有催化活性的进化压力。
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$ u1 F" m/ z, k' L+ l5 qO.H.Tam et al(2008) Nature. Published online April 13, 2008. 10.1038/nature06904
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T.Watanabe(2008) Nature. Published online April 10, 2008. 10.1038/nature069086 o' V/ d9 @1 i' j7 w
) O$ x& H" g5 R2 g# ]; h本文转自建人先生原创，感谢 |
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发表于 2009-4-28 21:55
发表于 2009-11-15 02:35
