一直不明白的一个问题，请指教！

gxbzjznn

一直不明白的一个问题，就是在做基因定量试验中，为什么要做标准曲线？谁能具体说一下？谢谢了。还有一般你们做标准曲线选多少个点？感激不尽

splinkerette

简单解释下，我理解的标准曲线的意义在于：确定你所用的引物在一定范围内是线性的，即是随着样品中模版量的变化而成比例变化的。只有这样，你得出来的QPCR结果才是真实可信的。

veda327

( W  x, x3 C, A7 w) M) g' K* z/ D( l# Y3 O! {8 H
绝对定量的标准曲线我们一般做6个点以及以上，这样出来的曲线以及方程更真实，如果只做4个点的话经过PCR过程的放大，最终结果的误差会相当大！5 t1 b6 o# d3 U4 v" C1 _
介绍如下，建议还是自己多看些资料！
8 b/ V4 j# n  a* x0 T" n6 {0 c: H7 ?. H' x  c
定量PCR定量的基本原理就是用已知拷贝数梯度稀释的样品作出标准曲线，未知样品和标准曲线相比较从而得到未知样品的量。无论是在基因表达分析实验还是在病原微生物检测应用中都有可能要做标准曲线，分别用于绝对定量和相对定量。8 a5 h) o/ y. f( ^( i
标准样品的准备1 l* t: P4 }" t, d
1、绝对定量。绝对定量就是要确定未知样品的拷贝数。对于这类实验标准品是通过某种方法制备得到的已知拷贝数的含有目标片段的核苷酸序列。最常见的是插入有目标序列的质粒，因为质粒是环状DNA有较强的稳定性，而且分子量比较大定量的时候比较准确。也有用线状的PCR产物作为标准品的，通常要比扩增的目标片段要大一些，这也是为了获得分子量比较大的片段，提高拷贝数的准确性。标准品的拷贝数是通过紫外定量的方法来确定，先得到标准品的浓度C(ng/uL)，因为无论是质粒还是PCR产物它们的序列都是已知的，这样通过通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出标准品的分子量B，这样标准品的拷贝数A(copy/uL) 为：
3 f6 o) T  O- ?1 f# `A=C/B×6.02E+14! y5 e3 |! P8 U5 y9 _8 z$ I, W
2、相对定量。主要是针对基因表达分析实验而来的，因为要知道都是相对的数值（对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。- d  F- s' a- ?8 `
实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合这种基因的扩增）。而对于各个稀释倍数要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数量，当然在基因表达分析中也不需要，而是要求根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如可以把前面稀释十倍的样品赋值为10000个拷贝，100倍的赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍的赋为10等。要注意，赋值的数目的倍数差异和稀释的倍数应该是一样的，比如前面是10稀释，后面赋值也是10倍变化。8 ~! {# l& o& _/ y
如何做标准曲线' t% Y5 O+ @4 c" [
在定量实验中标准品是要和未知样品一起进行定量实验的，这样在实验结束，无论是标准品还是未知样品都将跑出曲线，获得了Ct值。那么先可以把未知样品放到一边，对于标准品来说，既获得了Ct值，还知道他们的拷贝数（虽然对于相对定量来说这个拷贝数是我们自己赋予的）。这样可以通过标准品的Ct值和拷贝数做一条标准曲线（以拷贝数为横坐标，而Ct值为纵坐标）。一旦作出了标准曲线，而未知样品的Ct值知道（通过实验求得的），这时候就在标准曲线上进行定位，就可以得到未知样品的拷贝数了。& b& z' e8 [* }- P
事实上，操作起来没有那么复杂，只需要告诉软件哪个孔是标准品，哪个是未知样品，以及标准品的拷贝数等必要信息，软件会自动帮把标准曲线和未知样品的拷贝数计算出来了。- a' g/ _1 j" l8 U1 ?* R

gxbzjznn

回复 redmaple 的帖子( t" J) u( w% _+ C8 J
$ N: }9 y4 f  i/ S
至少五个吗？ 我们好像只做了四个

redmaple

是做实时定量吧？至少也得5个浓度梯度，这个说明书上都有。