细胞虐我千百遍??我待细胞如初恋 - 实验室综合讨论区干细胞之家



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楼主

发表于 2016-6-23 20:47 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

　细胞培养的过程大概是这样的：失败—成功—体味—收获—思考—交流，你到了哪个阶段？不妨和我们一起来看看丁香园上各位站友养细胞的那些事。# |* a0 Z- @2 H% o

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　　心肌细胞培养体会 # x3 P) Y2 Z: e9 @
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　　作者：windboy77" `) P) ^) w. V7 m2 W! K( y) ]- i

　　记得刚养心肌细胞时候，开始时候很顺利，但有一次突然细胞就不怎么贴壁了，换液时候一吹打，就发现有许多细胞脱落。我检查了培养箱，可是别人的细胞都长的很好，培养基的问题？我仔细观察了一下，培养基粉红透亮，绝对不会污染，血清也没有问题，大家都是公用的血清。2 l$ x4 H* P2 A6 w" w

　　当时我很迷惑，后来我向老师如实反映问题，他听完我的叙述后想了想，让我把培养基拿给他看，然后告诉我，你的培养基颜色太深了，肯定偏碱，细胞在偏碱的情况下培养，耐受能力会逐渐下降，可能是产生脱壁现象的原因。) S4 _: ?0 E3 z# S# t$ @2 D( Q

　　后来我重新测了一下培养基，为 7.5 左右，我用灭菌的 HCL 调了一下，培养基颜色变成淡红透亮。再次培养，发现细胞贴壁比较好了，搏动效果也不错。因此，我以后每次培养前都要重新调好 pH 值，我觉得很多因素是能影响 pH 值的，这也算是实验的一点收获吧。: k9 l8 y+ _6 d. U, A' A5 C
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　　低级错误浪费时间 9 O- [* r- e! g6 n

　　作者：冬日阳光

　　在做实验时经常会有一些低级错误的发生，例如，我在做细胞免疫组化时就发生了这样的一个错误：我的细胞是养在 24 孔板里的，细胞固定时我就直接加入了丙酮固定，结果板子里面一片白白的，这时才赶紧询问他人，方知塑料制品会被丙酮所溶，真是好笨。
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　　另有一次，我做细胞爬片时，因为觉得盖玻片不好处理，就自做主张地用了载玻片，那可是我自己花钱去做的小玻片。结果是虽然细胞长在了上面，但是用荧光显微镜观察细胞染色情况时却怎么也看不清楚，换用了盖玻片就好了。结果被实验室主任训了一顿：谁让你自做主张换玻片的？唉，不仅花了钱，浪费了时间，白费了心血，才得出这样的结论。

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　　昆虫细胞培养体会 % c! d2 `0 L- G4 k9 ?% ^. R

　　作者：savid888

　　鄙人也算养了快一年的昆虫细胞了，而且最近又在做昆虫血液的原代培养，积累了点点经验，说出来大家共勉。
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　　首先，要广泛阅读细胞培养方面的专业书籍，打造自己扎实的专业基础，为以后的操作做准备。这方面的书有很多，《体外培养的原理与技术》，薛庆善主编，科学出版社；《细胞实验指南》，D.L.斯佩克特，etc著，黄培堂等译；《细胞培养》，司徒镇强等。5 F; a- G+ l; B' v( c% X3 F* V
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　　其次，每种细胞的培养条件都不相同，别人的经验和书本上的 protocal 都只能作为参考，真正重要的是自己培养过程中的不断摸索，这就需要对自己培养过程中细胞出现的状况作详细记录，随时总结。
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　　再次，培养要有极大的耐心，过程中的影响因素又很多，这又是细活，其过程需要考虑各种影响因素，当出现问题时一一加以排除，找到最佳解决方案。我在这里没有讨论细胞培养的细节问题，因为那样的话是说不完的。% r5 y4 ^! x+ a1 r
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　　如何防止细胞污染 3 [$ F, u5 n2 T* y

　　作者：tangdl2000
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　　我就怎样防止污染说说我的体会。每个人都担心细胞被污染，每个人都有碰到自己的细胞被污染。起初我学习细胞培养的时候，都是向师哥师姐学习，基本上就是依葫芦画瓢。随着时间的推移，自己也就觉得有些步骤可以省略，有些就要注意。
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　　我个人认为比较重要的几点如下：4 {; e) C* g, R
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东西一定要用自己的。既不要借别人的，也不要借给别人。可能大家觉得比较自私。实际上还是很有好处的。并不是每个人的操作都规范，因此相互之间串着用，很容易造成交叉污染。* Y5 x" n, @5 ?+ J1 s& Z& h) M2 b
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我习惯口对口倒液体，在倒前倒后都要在酒精灯上过一下。自己认为比起用吸管吸更能很好的防止污染。步骤越简单，越能防止污染，而且还能节省很多吸管。/ _1 S# o+ |9 q4 `+ q! n0 b

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一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要做到半路，又出工作间拿东西，这样增加了污染的机会。1 G: I4 V2 h, @9 L/ Q$ |9 y3 C" O0 p

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整个操作要快、动作要轻、而且不要干其他的事情。比如手机响了，最好不要接。我一般操作的时候将手机关了，手机声音响起，好烦躁。# w/ j8 ^2 ^; T0 E2 }; o
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我一般开紫外线照射台的时候，就将培养基、酶、DHANKS 液拿到室外让它自然升温。这样 40 分钟后，温度也升上来了。有很多人将他放到 37 度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生，有的常年不清洗，里面很脏，容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水浴锅拿出后，最好找个毛巾插干上面的水。
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操作前要洗手，用 75% 酒精搽手。& v  i1 J) K% u6 e/ v+ x0 w' j# R

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用完操作台，要打扫卫生。3 g9 ~% ]2 m  B' c0 s

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细胞要经常冻存，我一般只要细胞状态好就将细胞冻存起来。细胞状态差了，扔掉，重新复苏。这是一个必须养成的习惯。毕竟很多情况下，细胞并不是因为污染了，才让你感到头痛。这样你不会担心没有种子了。8 d) j5 r- L$ r, G" J) U
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我一般是不加双抗的，只要注意，不会污染。

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　　纤维细胞培养经验
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　　作者：xiaoyuaizuguo
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　　我曾经在自己制作的无细胞真皮上养过成纤维细胞，无细胞真皮是按照文献的方法制作的，把成纤维细胞接种到无细胞真皮上的方法也是按书和文献中的方法。可是很奇怪，成纤维细胞怎么都不长，我重复了好多次，结果都是失败。后来又做了对照，同样的条件，一个平皿中直接接种成纤维细胞，另一个平皿中放入无细胞真皮，再接种成纤维细胞，结果，没有无细胞真皮的平皿中细胞长得很好。

　　这样说明不是细胞和平皿的问题，那么问题在哪里呢？我苦思了很久，觉得是不是无细胞真皮在处理的过程中用到了一些化学药品，对细胞的生长有害，可是在接种细胞以前我已经按文献上的方法将无细胞真皮用 DMEM 培养液浸泡了48 小时，在后来的实验中我就将浸泡的时间延长，并在中间每天换浸泡液一次，经过 5 天的浸泡以后，成纤维细胞的接种最终成功了。% i; |1 P, o3 t& k& X+ @( B

　　这份迟到的成功提醒我，对于书和文献上的东西，不能不信，也不能全信，很多东西还得靠自己在实验中摸索。

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　　悬浮细胞培养经验 $ p5 M8 m7 G. G+ f
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　　作者：liuhl - ]5 M- c! C! c  s6 g; B
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　　1. 无菌操作是一切技术的基础，切记此条。- }) K  b) h1 X8 @

　　2.在细胞状态好时，乘胜追击，准备好一切所需要的细胞原料。& @9 r( y' v3 `
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实验同时需要采用 FCM 检测药物干预后细胞周期的改变，需要做 IHC，Werstern Blot，RT－PCR 等时，可以现将细胞处理好后，根据不同的实验步骤，保存细胞标本，然后各个击破，这样可以减少实验时间。. k# f2 N( a% P9 A0 c# W9 Q2 H

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如要收集不同浓度点和时间点的标本，细胞处理后，部分用来做流式测周期（固定那步可以放置 -20 度数日，待标本收集全后一起检测）。部分用来细胞涂片（固定后，可以放 -20 度数月，本人曾放置 3 月没影响）。部分用来做 Werstern Blot（将细胞离心呈粉末状置 -80 度保存，或者提取蛋白变性后保存，粉末保存时间可达 2 月）。部分用于提取 RNA 时，可现加上Trizol 混匀后，置 -80 度保存。
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原料准备好后，在根据自己的时间进行合理安排，多出时间查阅文献。
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　　3. 在进行每个实验时，一定要找到该实验的详细的 Protocal，一步一步踏踏实实的完成，一般都会得到比较理想的结果。