分离单核细胞离心多少转速？

lily132

大家从血里分离单核细胞，最后洗剂时离心用多大转速呢？我用2000转5分钟，计数时发现有好多死细胞，不知道死的是红细胞还是单核细胞。

swtarron

关于离心参数最好用离心力表示，不然相同的转速，，相同的离心时间，不同的离心机由于转子半径不同，会有不同的离心效果。我们是用的250g/6 min，可作参考。

千细胞

材料来源干细胞之家---《人类血液来源免疫细胞库建设与管理规范》* D, R: ^( G; p8 B1 j. t: U

1 K" L5 A0 d' L" g& a# ^! N
( a0 s1 S$ W+ d) Y* s3 T" Z附 录 C （资料性附录）* |  \, u& v6 N
PBMC制备步骤
5 |" a0 i/ B- iPBMC的制备步骤见以下：. @1 c' f0 T# o( p. `* j! R
1) 将血袋中的血转移到离心管中，使用经灭菌消毒的剪刀剪断塑料管，小心把袋中的外周血倾倒入离心管中，将外周血袋热合封口。! H) M0 m  X1 G2 `& T' H) B
2) 离心分离出血浆，2000rpm，10min，室温离心。
* p% L' D" W  L) J0 U- i3) 离心完毕后分层，吸取上层血浆层到离心管中，贴上血浆编码标记暂于4℃保存。0 {7 t7 a6 o" v9 r4 b. a% D: B( F
4) 下层血细胞稀释：用生理盐水按1:1的比例稀释血细胞，混匀。9 V/ e2 U8 I. y8 l# Y$ l" T0 H; U
5) 铺层加样：将稀释的血液样本缓慢匀速的加入到盛有室温的淋巴细胞分离液上方，两者比例约为1:1，铺层的整个过程都应注意不能打破淋巴分离液与血液样本的分界面。离心：2000rpm，20min，室温,慢升慢降。: z5 `: P3 F3 K1 P
6) 提取单个核细胞: 离心完毕后，离心管内出现明显分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、ficoll层、单个核细胞层、血浆生理盐水层。吸取血浆生理盐水层弃之，直至距白膜层5mm处，小心将红细胞层之上的白膜层转移至50ml离心管中，补充生理盐水，细胞悬液与生理盐水比例大于1:3，混匀。
8 ]- O3 K9 o3 P  E/ v- b- Q  a! |7) 离心：2000rpm，10min，室温。8 W( E9 V1 k# W7 {2 O$ S" x
8) 离心完毕后弃掉上清液，用40ml生理盐水重悬细胞沉淀，混匀，取0.5ml混匀悬液计数。离心：1500rpm，10min。
  d# z* Y/ Y; J. V, V: ]2 l9) 离心完毕后收集上清液留作无菌检测，细胞沉淀即为目的细胞。
! K' w; {& T4 @$ K) Z* W8 T10) 以《中国药典》、《中国GMP实施指南》等为指导，针对前体细胞-外周血单个核细胞（PBMC）的分离、冻存、表型鉴定和功能检测等过程。

生物太次郎87

我的天呐，最后洗涤用这么高的离心转速，单个核细胞都送上了黄泉路了，我们是1500rpm、10min、升9降7。是为了洗去血小板。假如一次FICOLL离心效果不佳，可以再离心一下，最后一次900rpm、10min、升9降7。有疑问可以再交流。

HelenMalus

我们最后洗涤用的是1500rpm升9降7离心8min，单个核细胞离心转速不能那么大

我是传奇

2000转洗肯定会死，一般1200-1500，根据红细胞数量调整。

baby00000003

不能超过800g，一般离心全血这一类的粘稠细胞悬液最大800g，比如50ml一管，就800g＊20mins可以了
/ w9 U! W( g  n( Z4 Y# c比较稀的细胞悬液，比如培养完以后收获，400g＊10mins足足够用了

chenguangyu

300g 8min  or 400g6min

qinchuanniu

PBMC制备步骤6 s% Q% [, k7 y- a
PBMC的制备步骤见以下：! U. e: i- w* Z+ W2 v. y9 @- y; t. D6 ~
1) 将血袋中的血转移到离心管中，使用经灭菌消毒的剪刀剪断塑料管，小心把袋中的外周血倾倒入离心管中，将外周血袋热合封口。, N: ^; O8 }- f) j" B4 z+ h" `( N7 ^
2) 离心分离出血浆，2000rpm，10min，室温离心。) ~" {# |' a$ {
3 i* D: e# H# P 3) 离心完毕后分层，吸取上层血浆层到离心管中，贴上血浆编码标记暂于4℃保存。
* z, r% p! I4 @9 H5 s. v- H4) 下层血细胞稀释：用生理盐水按1:1的比例稀释血细胞，混匀。! v0 h+ V( w" V8 ]
& v# b* b6 }$ A) i* ? 5) 铺层加样：将稀释的血液样本缓慢匀速的加入到盛有室温的淋巴细胞分离液上方，两者比例约为1:1，铺层的整个过程都应注意不能打破淋巴分离液与血液样本的分界面。离心：2000rpm，20min，室温,慢升慢降。
1 d  u; Z/ H; P6 @1 e6) 提取单个核细胞: 离心完毕后，离心管内出现明显分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、ficoll层、单个核细胞层、血浆生理盐水层。吸取血浆生理盐水层弃之，直至距白膜层5mm处，小心将红细胞层之上的白膜层转移至50ml离心管中，补充生理盐水，细胞悬液与生理盐水比例大于1:3，混匀。4 Q: p$ }' ~/ m! R  s) Z/ z7 R0 P7 i! U
7) 离心：2000rpm，10min，室温。% h9 ^0 {) l. i5 ~+ m
' I4 D  G7 ?9 N5 @9 Y 8) 离心完毕后弃掉上清液，用40ml生理盐水重悬细胞沉淀，混匀，取0.5ml混匀悬液计数。离心：1500rpm，10min。5 c% x) ]# \% x9 F
9) 离心完毕后收集上清液留作无菌检测，细胞沉淀即为目的细胞。% Y& `$ k) \5 H" ^8 ~) d1 [
10) 以《中国药典》、《中国GMP实施指南》等为指导，针对前体细胞-外周血单个核细胞（PBMC）的分离、冻存、表型鉴定和功能检测等过程。

qinchuanniu

1.        分离血浆，1800rpm/min,15min
- u( d! ], x  y/ A7 \2.        吸取上层血浆，56℃、30min- K2 R8 U* l# [( f
3.        下层血细胞，生理盐水1倍稀释，人淋巴细胞分离液分离，2100rpm/min,20min
& s/ d: {7 i, y' l( Z# i4.        吸取白膜层，生理盐水洗2次，1800rpm/min,15min- s; }( E# F1 A# ]3 x
5.        细胞计数，加入培养基，CO2培养箱培养+ X1 e1 V; g4 G2 j/ o1 u