细胞爬片过程中的问题汇总

spkiller

大家在做试验过程中都遇到相似的细胞爬片问题，这是我简单的经验，也是以前在网上的摘抄，希望对大家有帮助5 a7 c5 e. a3 }0 E9 X2 _, y6 J
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第一，盖玻片需要过酸，并且自来水、蒸馏水冲洗干净。两张或者以上的玻片很容易因为虹吸作用粘到一起，很容易冲不干净，很容易把两张完全重叠在一起的玻片当成一张，一定要看清楚，晾干片子最好是在消毒饭盒中进行，饭盒底面放上纱布，将玻片斜靠在饭盒侧壁，玻片正面不要接触纱布，否则会粘上毛毛的。然后高压蒸汽灭菌，烤箱中烤干。1 w: y1 @, O5 r* d2 K$ F& x9 {
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第二，爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。这一步至关重要，否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。' a5 s1 H+ P4 A+ K5 X* A! {
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第三，传代消化下来的细胞一定不要过多稀释，将浓一点的细胞悬液吹打混匀后滴在玻片上，几个小时后再追加培养基。
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9 H& L- j3 ~( |# L8 b% }) p第四，玻片在培养皿中容易漂起，如果事先在皿中铺上液体很可能会不容易揭下来，或者揭下来时出印子在镜下很难看。漂起的玻片很容易两面都培养出细胞的，这时背面的细胞必须去除，挺难操作的，用PBS冲洗可能会伤到正面的细胞，用小镊子夹玻片很容易夹碎，也很容易脱落，小心点好。7 k4 |2 U6 Q. Y8 H. _& j' C
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第五，将玻片拿出后一定要记好哪边是正面，最好做玻片时将玻片切成长方形的。目前市场售的多为18mm x 18mm的盖玻片，或者24mmx24mm的盖玻片，正方形，很难分辨反正面，在某个角上打个缺口，对正方形是不中用的。可以用小砂轮切一下改成长方形，至于在某个角上用砂轮做个标记，理论上很简单，实际操作有难度。& W( ]  N9 I* N) X6 S+ A  E; F
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第六，上面步骤都没问题后，玻片就需要进一步处理了，这里有几个细节，分述如下：
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1.PBS对玻片是冲洗还是浸泡，我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏，每一步后都要冲洗2-3次，有时还没等试验做完，大部分细胞已经被冲掉了，呵呵！我当时欲哭无泪啊！
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2.4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4%26deg;C的好，有人认为37%26deg;C的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4%26deg;C冰箱中。我发现直接用4%26deg;C的溶液会造成细胞冷休克，从片上脱落。" b) b# p: A0 J( Y& _

" w- v6 {7 }! \7 \4 b3.用中性树胶粘盖玻片与载玻片时，尽量少滴树胶，一点点就够了，而且至少半个小时以上才能粘牢，防止在水中脱落。否则盖玻片就会移动，背面会出现树胶的印子，镜下很难看，而且擦不掉的。, G  U* e* m& x/ Q9 ]
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4.固定好的片子放到冰箱中保存，我倒没怎么试过，我基本上做好的就直接做免疫组化。
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丁香园网友CancerInsighter补充：
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. h) E5 d5 V- e: f- u$ v' Z" U首先，关于消毒的问题，如果细胞在玻片上的时间不到24小时，个人认为玻片泡酸、清洗就行了，不需要消毒。如果需要细胞在玻片上生长较长一段时间，则泡酸清洗后必须消毒。消毒时我喜欢把玻片放在盛有75%酒精的小烧杯里面，用的时候用镊子小心夹出玻片，在酒精灯上过一下（1秒左右，时间长了玻片会碎裂），玻片上的酒精会被点燃，待酒精烤干就可以用了。效果还是不错的，这种方法我用了半年，只污染过一次（还不一定是玻片的问题），而且每次细胞在玻片上培养的时间一般在7天以上。
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滴加细胞悬液的时候，事先细胞一定要混匀。如果细胞比较多，可以直接往培养皿或孔板内滴加细胞悬液，覆盖玻片，轻柔混匀，注意呈%26ldquo;十%26rdquo;字形摇晃。如果细胞数量少，需要把细胞都滴加在玻片上，则要先从边缘开始，然后再往中央滴，这样有利于细胞均匀分布在玻片上。滴的时候速度要慢，让液体依靠表面张力呈薄层覆盖玻片，要防止细胞悬液溢出玻片。这样一般2-4小时后细胞就贴壁了，这时候再补足的培养基，覆盖波片。* P. q3 [3 i7 P2 v

1 M1 j1 N& m1 X# K. f' T玻片的正反面。这个没注意有可能前功尽弃。关键是取、放玻片的时候要全神贯注，不能搞反了。采用其他的方法可能更麻烦，不如自己小心点。另外取玻片的时候，由于玻片比较薄，可以用1毫升的胰岛素注射针自制一个钩子，把针头折弯就可以了，这样取玻片的时候比较方便。 ' F* K& X9 E9 e6 I2 }0 @
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染色滴加抗体时，为了节省抗体，可以先把抗体滴加在干净的载波片上，然后玻片的细胞面朝向抗体倒扣，同时注意防止气泡 和玻片的正反。一般24毫米的玻片只需要30-50微升抗体。当然如果操作不熟练，抗体又足够，那就直接在玻片的细胞面上加抗体吧 。3 t0 _3 U/ x2 W  G7 h; ?
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玻片上细胞的漂洗。我从来不冲洗，只用PBS浸泡，泡了就倒掉，半分钟都不到，时间的长短个人感觉影响不大，能把残留的抗体洗掉就行了。
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细胞爬片固定好以后，如果要保存，我们的做法是倒掉固定液，PBS漂洗后干片保存在4度，最长半年没问题。当然可能不同抗原的保存效果不一样。