养脐带间充质干细胞等问题

gm3771052

我用的是 脐带组织贴壁法：处理 剔除 动静脉，然后剪碎，离心，培养瓶培养。5 w& Z- M) q4 R0 g4 X
用的是无血清培养基（要求无血清的）   培养基是以前同事推荐的他们公司在用，他们培养的还行。& X6 p: E- b1 o) s
  基本上第一次换液5到7天，在第二次换液基本上就有原代细胞出来了。
$ Z7 T; \5 w3 l, _3 ?- T4 U最我在养脐带间充质干细胞遇到了一些问题：
; R' o/ q5 e" A' J9 p7 V! I, r1 原代细胞里面有很多红细胞
2 C4 z) I: h8 U/ Q5 ~4 A! V我想知道红细胞有没有好的方法去除，是不是操作的原因导致的红细胞多。红细胞对间充质干细胞生长有没有影响。
' s3 Z% S5 T3 s2原代细胞出现了老化的现象
0 U; y% V8 ?6 ], Y+ u! i1 O原代细胞个体很大，形状很差，不规则
# `# m+ M% [& z( y) J1 c3传代后P1个体也很大，形态更差了
% S; S2 `) x  P5 l+ [" q, n, z0 \考虑到可能是脐带个体差异，所以我又培养了一根。情况跟上面的差不多，所以很苦恼，希望有经验的朋友给点建议- _8 ]: z1 f. ~; F6 _5 s& F; G
看看能从那些方面进行改进  ：流程？   还是培养基？     

五口二木

回复 gm3771052 的帖子
5 ]  u) ~) s' r; U/ o0 f
  u0 a) O: \# o8 C无血清培养基我没用过，不过刚用低糖DMEM培养基的时候也是出现同样现象，根本无法往下传代，后来换了培养基就顺利了

sunyandong

脐带要用盐水清洗干净，另外要去掉羊膜，只要华通氏胶

saliai2016

8 R( _0 b2 z- P# a
8 c6 z0 v4 g" m4 [5 M3 l
我来回答你的问题：
; }) f. S$ {$ W: \
+ q0 R2 X: O" N  s1 u8 M1 原代细胞里面有很多红细胞
3 Y# h; l; L8 s1 p: L1 Z* [  e, H我想知道红细胞有没有好的方法去除，是不是操作的原因导致的红细胞多。红细胞对间充质干细胞生长有没有影响。, {5 ]6 U! \0 Z
解答：红细胞是因为脐带静脉动脉中的血液，没有去除干净。在剥离脐带前，用2把镊子夹住脐带，来回刮脐带，挤出血液，连续用生理盐水清洗，脐带太长的话，剪短点，用镊子夹住刮脐带，排除动静脉中的血液即可，效果非常好。
" u5 M! Z) t6 B7 k8 V. q4 o1 R4 [% {/ {- D
2原代细胞出现了老化的现象
. v) f- ^$ y7 i! R( n- _原代细胞个体很大，形状很差，不规则
+ b5 m* {' k: T4 l. o( o解答：原代老化，原因可能是：培养基有问题，一般DMEM/F12+10%FBS(Gibco)的培养方式是没有问题的。另外可以加一些生长因子如bFGF等。静止培养一周后，适当换液，观察是否有细胞贴壁生长。原因二：脐带分离，还需要去除表面一层膜，你没有去除干净，细胞也会很杂。% y7 a4 ~: |* c' u

, C" P, H$ H( `: h3传代后P1个体也很大，形态更差了 " h, l* e3 H9 t8 x/ Q
考虑到可能是脐带个体差异，所以我又培养了一根。情况跟上面的差不多，所以很苦恼，希望有经验的朋友给点建议0 @, U6 h1 n1 s9 @
看看能从那些方面进行改进  ：流程？   还是培养基？   
1 ~1 p1 @# ]; G, ?- w8 ^2 X4 R6 v, S+ Y1 M
解答： 参见问题2，原代没有培养好，传代细胞只能更差。

gm3771052

回复 saliai2016 的帖子
9 l0 g4 t7 J$ ^* F6 W# P1 F6 {+ r4 D* h. X6 N) A/ b( c
非常感谢！！！！！！！

晗晗

里面红细胞太太多可能是因为血液没有洗干净.用缓冲液多洗几次,一定要洗干净
$ x# u) D9 W/ B. R还有就是细胞老化,可能是因为你养的时间太长了,你要勤看看,5-7天换液是不是时间有点长啊,一般看看2-3天就换液看看,还有就是细胞你刚养的时候每天都看看,希望对你有点帮助

15122224893

我用无血清培养基和F12+10%FBS比较过，无血清的长得稍慢但是状态还是很稳定的

ljj0558

红细胞较多的话，谨记一定要清洗干净。分离华通氏胶时，就要尽量清楚血液。
3 _* n5 x8 n5 C2 s* b; e3 C至于细胞形态变化，可能是原代细胞接种密度的关系。谨记传代时细胞密度在30%左右，细胞传代的密度也不要太高。

woshibotao_01

细胞已经成片状了可以废弃了

luyue6453

回复 gm3771052 的帖子# [0 k  h" e, J, R

( ~3 A/ {4 A& b4 D" t" g% t1 Q" S) U9 G5 ~红细胞太多主要是没洗干净，你可以把华通氏胶剪碎后放到试管中，反复用生理盐水冲洗，离心，冲洗离心，至于细胞过老化建议你换血清试试，培养液血清对细胞形态影响很大，最普通的DMEM都可以养起来的。