多种工具带你深入DNA甲基化

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多种工具带你深入DNA甲基化
, L- K  _, H. P来源：生物通 / 作者：叶予 / 2016-11-24
8 N0 Y- O9 I8 j6 m近年来，表观遗传学尤其是DNA甲基化引起了人们极大的研究热情。在芯片和二代测序技术的帮助下，研究者们通过检测基因组的表观遗传学状态，鉴定了大量值得深入研究的甲基化区域。* {; x0 o. x( p4 }; x; X) w
应该如何进一步研究或验证这些区域呢？对大量样本进行全基因组扫描显然是不现实的，这样做的成本太高。实际上，也没有必要为了部分区域去检测整个基因组DNA，本文介绍的工具就足以完成这样的任务。  e5 r  e, Y$ `. ]) F1 ]1 s3 |
甲基化特异性PCR& }6 r7 J8 q. W8 l# b4 K
甲基化特异性PCR以重亚硫酸盐为基础，是评估少量位点甲基化状态的一种常用方法。
4 N# v0 C0 M$ @: u5 I* V4 n用亚硫酸氢钠处理甲基化DNA，可以将未甲基化的胞嘧啶残基转变为尿嘧啶，而甲基化残基保持不变。特殊设计的PCR引物能够加以区分，然而人们可以根据扩增产物来量化给定位点的甲基化状态。
1 A- U1 p  F* P- r5 n许多研究者都会在亚硫酸氢盐转化之前，先富集甲基化的DNA。这样不仅能够降低背景，也可以节约成本。Active Motif公司就提供有这样的甲基化富集工具，MethylCollector™ Ultra kit利用含有甲基-CpG结合结构域（MBD）的蛋白来捕获甲基化序列，而 MeDIP kit使用anti-methyl抗体来完成这项工作。
$ Q3 l$ ^$ T& Y1 w4 nActive Motif公司的表观遗传学产品经理Kyle Hondorp介绍到，这两种方法虽然理论上是一样的，但也存在着细微的差异。Anti-methyl抗体能够检测任何甲基化事件，除了传统的哺乳动物CpG甲基化，还有CpA、CpT二核苷酸中的甲基胞嘧啶。但MBD不能识别CpA、CpT二核苷酸中的甲基胞嘧啶。另外，MeDIP抗体只识别单链DNA中的甲基化，而MBD能识别双链DNA。
5 J5 S5 P8 I$ M% x! e限制性酶切
# b+ Y5 V$ j1 d. l! e1 m这种分析依赖于能够区分甲基化和非甲基化序列的酶。  O$ q6 P8 K' w
有些限制性内切酶可以区分甲基化和非甲基化序列，比如HpaII和 MspI（切割C^CGG），还有AccII（切割CG^CG）。这些酶对DNA的甲基化状态的敏感，切割甲基化和非甲基化序列的效率不同。酶切之后可以通过qPCR或PCR读取结果，也可以用HELP assay（HpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR）进行分析。
, F8 t) F& w& E7 y+ l酶切法能达到接近单核苷酸的分辨率，同时又避免了重亚硫酸盐对DNA造成的损害。
& f+ D' Y! i& G# o质谱分析
6 e( l7 {' {" j$ \# t8 V收购了Sequenom生命科学业务的Agena Bioscience，在MassARRAY® Analyzer 4的基础上开发了EpiTYPER®，这是一个MALDI飞行时间质谱仪。
3 g0 z( M: `% d$ ], L' F5 {这一策略也是先用亚硫酸氢盐进行处理，将DNA中未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。随后通过DNA回收和PCR扩增，分离出500-bp左右的目的区域。在体外将扩增产物转录为RNA并用RNAse A处理，这种酶会在尿嘧啶后面切割，酶切生成的片段化模式依赖于DNA的甲基化状态。这些片段化的RNA产物，可以在MassARRAY Analyzer中进行分析。
( J- N) X5 a% C+ J据Agena 公司的Robin Everts介绍，这种分析法可以评估PCR片段上的多个CpG位点（≥20个位点/片段）。“这是一个验证工具，”Everts说。“如果你在全基因组甲基化筛查中发现了感兴趣的区域（高甲基化或低甲基化的区域），就可以用质谱分析在大量样本中检测相应的扩增子。”1 A3 H5 y  ]' K# Y7 J" F2 t' {
羟甲基胞嘧啶8 N/ I0 G. D6 O
一般的甲基化检测工具很难区分5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。
, o; S& f9 _6 K$ sActive Motif公司的hMeDIP试剂盒，可以通过anti-5-hmC抗体特异性富集含有这种修饰的DNA。该公司的Hydroxymethyl Collector™试剂盒也能富集5-hmC片段，其策略是先用beta-葡糖基转移酶将葡萄糖偶联到5-hmC残基上。这个葡萄糖经过化学修饰，含有叠氮基团，可以随后连上生物素。连有链霉亲和素的磁珠，可以收集这些生物素化的5-hmC DNA。
" i. n8 W; X2 T4 Y5 y  ?5 VNEB公司的限制性酶AbaSI，能切割含有5-hmC的DNA。这种酶能特异性消化，被beta-葡糖基转移酶糖基化的5-hmC DNA，并在距修饰位点11到13个碱基处进行切割。“AbaS1的分辨率差不多能达到碱基水平，”NEB公司的Sriharsa Pradhan说。据介绍，人们已经用AbaS1在小鼠胚胎干细胞的基因组中定位了5-hmC的分布。+ @  i2 k& U+ S  X: r5 K+ B
NEB的EpiMark® 5-hmC 和 5-mC 分析试剂盒采取了另一种策略。先给DNA上的5-hmC残基连上葡萄糖，然后分三个反应进行。第一组用限制性酶MspI处理，这种酶能切割甲基化和未甲基化的DNA，但不切割连有葡萄糖的羟甲基化DNA。第二组用HpaII处理，这种酶不能切割甲基化（或连有葡萄糖）的DNA。第三组不进行处理。对这三个反应的产物进行PCR扩增，可以为人们揭示哪些位点有羟甲基化，哪些位点有甲基化，哪些没有受到修饰。“我们可以得到不同甲基化类型的精确百分比”Pradhan说。6 f' |0 D6 Q* E0 r
靶向测序5 `4 r% }, @# S- Z
用靶向测序检测DNA甲基化，需要先定向捕获目标序列，进行重亚硫酸盐处理，最后通过二代测序定量目标区域的甲基化位点。
' R6 ]  X; D& [8 o( c7 J# \  {罗氏NimbleGen的SeqCap Epi kit和安捷伦的SureSelectXT MethylSeq通过大量核苷酸探针，捕获能甲基化的区域（不依赖该区域的甲基化状态）。安捷伦的Kyeong-Soo Jeong介绍说，SureSelectXT MethylSeq能从基因组DNA中富集84Mb的片段，当然用户也可以定制靶标200 kb的片段。不过，捕获小片段可能没有捕获大片段那么有效。这类产品收集的DNA随后可用于重亚硫酸盐转化和测序。0 }8 w4 r4 T4 R+ M
这样的富集策略更有优势，Jeong说。以抗体和蛋白为基础的富集方法，偏好比较密集的甲基化区域。“我们的技术不依赖于甲基化状态或者DNA的CpG密度，”他说。“可以将靶标的所有片段捕获下来。”
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