人胚胎干细胞实验室研究的十五个小窍门

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威斯康辛大学WiCell研究所“人类胚胎干细胞培养方法”培训班的首席培训师Daisy  Manning，在那里上了一堂人体胚胎干细胞研究的入门课。
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! d7 t, T2 ?3 J4 N, q& X) v        Manning在一间专为学生实习准备的实验室里讲授了这堂人体胚胎干细胞研究速成课。在这里学习过的学生已经达到230人。课程涵盖所有关于培养干细胞的基础知识，从准备鼠胚胎纤维原细胞培养基支持层，到冷冻人体胚胎干细胞等等，除了定向分化以外的每一个步骤。
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* Z; f- l1 |5 R0 o( }        Manning不仅鼓励那些想在自己学校开始干细胞研究计划的人们参加课程，还鼓励所有符合条件的的研究者来这里上课：“我经常说的一句话就是，如果你在这里犯过一个错误，这是件好事，因为这样一来等你回到自己的实验室时，就不会再犯第二次了。” . p& B  _, a, L! P% h" ^! F

* u/ L% r) |" j        1．抓紧时间、耐心等待
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& T5 f& K3 J4 J/ N: U; W        Manning告诉这位编辑：“我们让学员们了解到人体胚胎干细胞研究不是个短期工作，即使实验室中一切都已经就绪，那最少还要花费十六周时间才能完成从衍生鼠胚胎纤维原细胞到完全培养出大量人体胚胎干细胞然后进行冷冻。所以，整个细胞实验过程在有完备实验室的条件下也要花费四到六个月。”
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        2.  千万不要购买商业性的鼠胚胎纤维原细胞 1 Z" i2 c  W; Y9 {3 G- x) A+ U2 g3 Y
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        虽然能买到鼠胚胎纤维原细胞，但是WiCell研究所建议还是自己培养为妙。“从怀孕的母鼠体内能够获得12到15瓶，成本只有26美元。如果从商业市场购买的话，4瓶鼠胚胎纤维原细胞就要花掉50美元，也就是说用两倍的价格只能得到六分之一的细胞。此外，买回来的根本就不知道是什么样的鼠胚胎纤维原细胞。通常最多只能用到第五代细胞，因为之后这些细胞会大量死亡，有些供应商出售第三代或第四代的鼠胚胎纤维原细胞，这样一来它们对于胚胎肝细胞培养来说根本毫无用处。”
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        3.  检查辐射源
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        研究过程中，必须使用辐照来暂停生长。Manning  表示，WiCell研究所的规定要求辐照剂量应该为8000拉德（辐射剂量单位），但这是一个变量。“因为我们在实验发现，随着辐照源的不同，辐照量也会变化，”她补充说。“对于铯辐照器来说，8000拉德正好，但是对于X射线来说，辐照量需要在12000拉德以上。”虽然这一过程可以使用丝裂霉素C来代替，但是Manning建议还是尽量使用辐照的方法。“胚胎干细胞对化学药品十分敏感，”她解释说。“当你用化学药剂来钝化鼠胚胎纤维原细胞时，一定要保证在加入胚胎干细胞前清除了所有的化学药剂。” & Y% \% ]3 c9 J7 A

' C/ G! g: g+ l( Y. H! C% k1 t        4.  快速解冻！
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        Manning告诉这位编辑：“尽可能快地解冻细胞。这是因为我发现有几次我和另一位学员解冻的细胞在几乎同等条件下，她最后所得到的细胞团只有我的50%左右。虽然我们使用的时间只有30到45秒左右的差距，但是最后我们所取得的结果差别很大。”她建议，尽可能在实际解冻胚胎干细胞前按照要求操作几次，这样有助于减少浪费时间。

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5.  两周的等待
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        别想着在解冻后很快就会培养出大量的细胞，在这一过程中只有0.1%  到  1%的细胞能够存活下来。Manning说：“我们一直告诉学员们每天都要注意它们的发展，因为细胞团随时可能会出现，也许三、五天，甚至七、八天，突然之间你就会发现细胞团出现了。”解冻十四天后还没有出现细胞团并不意味着实验失败，而且不要忽视外表组织的边缘，她补充说。“因为很多时候这些部位会出现大量的细胞团。”（用手指放在外表组织的边缘挡住光线衍射就能看到。） ; i9 P& b6 O. e
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        6.  每天对细胞的培养
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0 p) m. |. ^% W% s# _        要每天观察人体胚胎肝细胞的生长过程并添加养分。“而且永远别让它们过量生长，一般来说这些细胞每周会分裂一次。”人体胚胎干细胞的机构紧密、均匀而且边缘清晰，而分化出的细胞团参差不齐、边缘凌乱或者有透明的中心点。在低倍数的放大镜下，健康的细胞团发白，而那些在溶液中发黄的细胞团类似发育中的胚胎很有可能会分化。 ) t4 n5 [+ |/ \2 i

$ c1 P$ a( g( I. A9 E" |        7．越多关注、越多收获 $ Z! G( B% S' `

/ T) K, R2 `/ g1 F2 J% S* L        经验丰富的人体胚胎干细胞研究者一般都十分关注细胞的生长过程。“如果一个研究者关注细胞的生长，就会花费很多时间用显微镜观察它们，而且会熟悉分化前这些细胞的外表特征。久而久之，他就能学会预测下一步细胞会产生什么样的变化。”  Manning补充说，因为人体胚胎肝细胞比其他科学研究更讲究，所以很多东西在课堂上是无法传授的，但是培训课程能够帮助学员学会如何做出正确的判断。
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- D3 m) h( d  ~% G7 @        8．  分化开始 ; f) `4 `/ t0 H9 L) ^6 u( P" @
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        ESC分化虽然会给细胞的培养带来一些困难，但这也是件好事，它表明培养基很健康。如果培养基没有出现任何问题，那么很有能已发生了什么问题。“当胚胎肝细胞突然生长的很快，很健康，而且从未分化过，那么你就该想想是否有什么地方出了问题，”  Manning解释说。 , {- \0 W5 I7 K$ H

) O( d% L% O( H) Y# J# r8 x        9．决定研究步骤
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        Manning  告诉这位编辑：“对于如何处理人体胚胎肝细胞培养板，我们有一条不成文的规定：那就是对于分化率为10%的培养板，我们不做任何处理；如果分化率在10%到50%之间，我们会用一种叫做‘挑选移除’的方法去掉分化了的细胞；如果分化率大于50%，用‘挑选保留’的方法借助机械将未分化的细胞团转移到一个新的鼠胚胎纤维原细胞培养板上。”

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10．避免“挑选保留” * Y/ [/ w, ^% c* b( o) `, X% s2 p2 F- Q

2 B$ S: ^. _* ], ^, g        Manning表示，如果一个研究者经常需要使用“挑选保留”的方法的话，那么他的操作可能有问题。“一般来说培养过程中每隔一代就要做一次挑选移除工作，这个时间段或许有小许误差，而且绝对不能打断分化过程。如果每隔一个月或每三个月就要做一次挑选保留工作的话，就有问题了。” 1 E" h4 V3 C# }2 x4 K5 j& j- e- F
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        11．  别做完美主义者 & M% n! X) S5 c5 K( w

2 s( u8 Y/ Y$ [# ]1 o        Manning告诫这位编辑说，过于频繁的挑拣会导致异常细胞出现，所以千万别做完美主义者。她补充说，也许研究者会看到培养板上有2%或3%的分化部分，那并不算什么，而且这些细胞团完全正常，但是如果每个月研究者都不停地进行挑拣，让培养基上完全没有分化的部分，那么很有后可能会导致产生诸如三体型12或17这样的异常现象。“所以不要过于热切。 + v$ H* Y+ N4 J
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        12．  千万别用抗生素
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        “我们发现如果细胞培养方法和消毒手段都很完善，那么根本没有必要使用抗生素，”  Manning说。此外，它们会严重地损害培养基。“你不知道在加入了另外一种成分后，它对胚胎肝细胞会产生什么样的影响。这些抗生素可能会导致异常细胞的产生。”
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        13．  别忘了染色体组型
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* Q7 e. ?! o4 L. M- r: Z0 K        WiCell研究院对第二十代和二十五代细胞进行染色体分类，这样来保证它们拥有正常基因。Manning说：“我们建议研究者在开始实验前就进行染色体分类，这样能够保证它们都处于正常状态。然后，在开始收集、发表大量数据时，一定要再次进行检查，而且我们认为在第五十代以后，每十代就要进行一次染色体分类。” 5 }  b! z% @  p# p6 `
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        14．及早、经常冷冻细胞 ! {: d* r2 Q3 a9 V! n& m

+ I2 ]" S0 g! c8 H' l7 ]  m        Manning说，在解冻后尽快积累一些备用冷冻胚胎细胞，一旦研究者开始冷冻后，总是希望尽快完成这一过程，因为这样才能将传代细胞的数量降到最低。千万别等到细胞越来越多的时候才开始冷冻过程。细胞在能够分裂的前两天就应该冷冻起来，而到了第五天它们的生长最快，也最需要快速解冻。
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- ^5 @8 j' ^9 g/ g$ a; h        15．这是一份全职工作
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! Q8 S6 M9 A3 |* L$ N. Y        Manning强调说，人体胚胎细胞培养实际上并不清闲。培养鼠胚胎纤维原细胞与分裂培养人体胚胎细胞的过程就需要每周20小时以上的时间。这样，研究者就必须训练一个助手在自己生病或休假的时候来培养细胞。“一个人单独做这份工作实在是太费心了，所以一定要找个帮手，”她说。