一种高效识别蛋白精氨酸鼠李糖基化多克隆抗体

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来源: X-MOL / 作者: / 2017-01-227 r( Z3 R, \- I- ]
在很长一段时间内，蛋白质糖基化修饰被认为局限于真核生物。而今天人们广泛接受了包括重要的人类病原体在内的细菌当中也含有大量的 O - 以及 N - 糖基化修饰。但是其中关于 N - 糖基化修饰的报道似乎仅仅发生于天冬酰胺上，直到 2013 年，北京生命科学研究所邵峰课题组和澳大利亚墨尔本大学 Hartland 课题组同时发现来源于肠致病性大肠杆菌 (EPEC) 的三型分泌系统效应蛋白 NleB 家族，以一种新颖的 N - 糖基化修饰 Arg-N-GlcNAc 作用于宿主的死亡受体 (TNFR，FAS，TRAIL- R 等) 及其接头蛋白 (FADD，TRADD，RIPK1 等)，通过阻断死亡结构域介导的 DISC 复合体的形成抑制死亡受体诱导宿主细胞凋亡和坏死。这些研究表明，精氨酸糖基化有可能广泛参与基因转录、信号转导、细胞生长与分化、细胞节律以及免疫等多个重要的生物学过程。
2 }' K! U( P4 y- J3 R5 U: i2015 年，德国慕尼黑大学 Lassak 课题组在 Nat. Chem. Bio. 上报道了另一种重要的精氨酸鼠李糖基化修饰（Arg-N-Rha）。包括绿脓杆菌、百日咳菌、淋病奈瑟氏菌在内的多种致病菌都能特异性地通过 EarP 酶对转录延长因子 EF- P 中 32 位 Arg 进行 N -Rha 修饰，当 Arg-N-Rha 的 EF- P 绑定到核糖体之后，其鼠李糖基化修饰的精氨酸能够到达转肽酶中心并为包含脯氨酸转移酶的 tRNA 提供有利位置，从而稳定了脯氨酰 -tRNA 的 CCA 末端，最终实现核糖体的解救。因此，Arg-N-Rha 修饰在多种细菌的致病过程中发挥重要作用，而抑制 EF-P 的 Arg-N-Rha 修饰可能成为一种开发新型抗生素的新策略 (Fig. 1) 。
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虽然目前存在着多种检测蛋白糖基化 (如蛋白 Ser/Thr-O-GlcNAc 修饰或 Asn-N- 糖基化修饰) 的手段和工具，但如何检测人蛋白组中是否还存在其它重要的 Arg-N-Rha 修饰蛋白尚缺乏相关工具。另外，特异性抗体的制备不仅对于基于抗体的大分子抗生素的设计有实践意义，而且能为新型小分子抗生素的筛选提供了十分有利的工具。
& h* g/ E; U2 e/ b  }近日，由第二军医大学的胡宏岗教授课题组主导的包括德国慕尼黑大学、欧洲分子生物学实验室等多个研究团队在国际上首次成功开发了一种高效识别 Arg-N-Rha 的多克隆抗体。他们首先通过核磁手段确证了 Arg-N-Rha 修饰的构型，随后在固相上对多肽直接进行糖基化得到含有 Arg-N-Rha 的糖肽，并将糖肽与牛血清白蛋白 (BSA) 偶联作为抗原对家兔进行免疫，最终将得到的抗血清进行亲和纯化，首次得到特异性抗精氨酸鼠李糖基化的多克隆抗体(Anti-ArgRha) (Fig. 2)。6 k& r0 U4 [, u8 X) `
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得到 Anti-ArgRha 后，由德国慕尼黑大学 Lassak 课题组利用 ELISA 和免疫印迹的手段验证了该抗体的特异性和灵敏度。结果表明： Anti-ArgRha 能够特异性靶向 EF-PRha，却不能识别没有糖基化修饰的 EF-P。当 EF-PRha 浓度恒定在 25 μg/ml (1.25 μM)时，最低可以使用 0.04 μg/ml 的抗体浓度来检测到 EF-PRha。当保持 Anti-ArgRha 浓度恒定在 2μg/ml 时，最低能有效检测出 15 ng 的 EF-PRha(Fig. 3)。其次，EF-PRha 对 Anti-ArgRha 的特异性至少比 L - 鼠李糖、L- 岩藻糖或 L - 精氨酸强 10,000 倍左右。此外， Arg-N-GlcNAc 糖肽能够特异性地被 Anti-ArgGlcNAc 识别，但却丝毫不能被 Anti-ArgRha 识别。最后，他们还证明了该特异性抗体能够识别细胞裂解液中的内源性的精氨酸鼠李糖基化蛋白质。
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这一成果近期发表在《Chemical Science》，文章的第一作者为第二军医大学博士研究生李翔和德国慕尼黑大学博士研究生 Ralph Krafczyk。
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