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进入肿瘤干细胞领域已经半年了，由于有很多瘤块资源所以有较多动手机会。以下为一些方法和心得。
) @; B. b$ |; \0 W- o1 v. }" E* L1，瘤块的消化0 o8 L$ s6 O: N% ?+ F; X
因为实验比较紧迫，根据文献报道我们采用0.05%胶原酶I作为通用消化酶，不论组织来源，胃，肝，食管，前列腺等均相同。如果有足够的时间可以去细细的分类消化，应该会有意想不到的收获。瘤块用镊子尽量剪碎，过滤低速离心后用胶原酶重悬，消化时放入孵箱后每隔十分钟摇晃一次，二十分钟用吸管用力吹打同时显微镜下观察瘤块是否分散同时观测细胞活力。随着时间推移，瘤块越来越分散，而存活细胞逐渐增多。当瘤块致密形态缺失或者单个存在细胞特别多时终止消化，消化亦不要超过2小时，同时可以采用分步消化法。过滤去除较大团块，低速离心去除杂质，可以多离几次。
" V1 R" z# f( m: q2，培养基的选择7 p, s; T( y0 A G# m# Y. ?% `( C
我们采用无血清培养基，加入bFGF及EGF5 p2 ?& h+ O7 o
3，培养板的选择' j6 @% X |) f& v1 S
我们采用普通细胞培养板，准备开始使用低粘附培养板，因为在干细胞培养过程中发觉有些细胞仍旧贴壁生长，而且有成纤维细胞。但是很大一部分仍旧为团块生长。所以具体实验可以分别对待。
+ {- j: _& \4 I% T) H4，团块的传代
7 I, ^ _9 T9 ~6 B7 V0 ~我们采用Tryple作为消化酶消化团块，消化后40um滤过出去较大团块，之后低速离心计数，之后计算克隆形成率观察传代次数及干细胞纯化的能力。此为干细胞自我更新能力的检验。% n7 W# f* Z1 k% ?, O% p
5，干细胞分化能力
" Z7 G' u+ O6 o4 t* Z! x. |4 w/ I" x用含有血清的培养基培养不同时间点，最多做到十天，观察不同干细胞相关基因的表达水平变化。同时可以用3D培养方法做克隆团免疫组化观察表皮，肌上皮等不同分化marker来定义克隆团的分化。3 f* q9 r5 j8 k! o: W, x% D% E
6，TCA' c7 w/ L; W, M! n2 B3 U! z6 g( ?
有些人认为在琼脂中可以克隆生长的均为干细胞。但是本身体系是加入血清的，所以又有些人持怀疑态度。细胞系很多可以生长出较为漂亮的克隆。
6 K& ]5 H$ |0 H/ b! B% j7 t7，SP分选
5 [! i3 V- q1 Z* j2 L还是比较常规使用的干细胞分离方法，但已经有一部分文献已经报道此方法并不能应用于更多的组织来源细胞分离。
: H; v4 q! |# @$ @+ P" e8，动物实验
0 f. K* v# n6 z金标准，如果可以找到一个细胞就可以成瘤，那么它肯定是干细胞，如果干细胞真的存在，已经有人报道了。我们现在做到了几百个细胞成瘤在培养40天以后。做的是皮下注射。下一步准备做原位注射之后观测瘤块生长状态及其转移。
# q, D# `( Y8 Z- A% d; m( b9，在药物研发中的作用
1 f. W% C) T) [这许多年癌症的治疗去的很大进步，但是要达到根治或者预防复发仍旧任重而道远。肿瘤干细胞的发现及其在药物治疗靶点的发现必定为肿瘤的治疗带来新的希望。祝福大家。 |
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发表于 2009-6-19 15:25
发表于 2009-11-26 11:15
