无血清培养液浑浊且有黑色点点的渣渣是怎么回事急急急！！！

hjqincc

最近，这两周利用无血清培养富集肿瘤干细胞遇到很头痛的问题！; e' F6 P, u- }$ G( [# z& a
从含有胎牛血清的培养基转移到SFM培养基后，一两天后培养基就出现浑浊，密密麻麻的黑色的点点。在这期间除了从培养箱拿到显微镜下观察球囊的形态外没有做其他的处理。
% U5 v2 @/ @. Q, @6 z富集前的细胞状态一直不好，难不成是产生的细胞碎片之类的？% i. S1 J' Y, r9 Q  h
基于刚开始做，细胞富集的较少，所以培养基基本上每次都是现配现用。个人觉得该不是培养基配制时出现的问题。而且我将培养基单独装在培养瓶里就没有发现培养液变浑浊。
# l2 Z( E8 \* n; z+ t因初涉此实验，很多方面或细节注意不到，望各位不吝指教！

痞子的烟头

听你描述，推测可能是黑胶虫
* f6 v5 _8 `) ^4 f  I! T7 I建议换一批细胞！

zpzp0312

http://www.stemcell8.cn/viewthre ... amp;page=1#pid23018! K/ z9 K) M1 a1 J; Z! C' {/ o
5 U' K$ V$ ]5 I& [& K
污染是一件人让人头痛的事情。
, }! O$ N, W$ l, y8 R所以建议要从各方面找原因，并尽量避免问题的发生。8 ?# P) |( g  l+ T( N" I3 j
实验操作的各个环节都要细心仔细。( d  A# l7 j  s2 Y0 g
细节决定成败！~~~

zpzp0312

希望楼主能发几张图片

hjqincc

2# 痞子的烟头 : Q, e2 p0 h$ I

. P% F, a9 t0 }0 ~* k4 r1 {+ @+ u& `# p; ?3 n
前一段时间，我们实验室确实出现过大批污染，怀疑可能是黑胶虫。但是清理过了，当时也没有富集肿瘤干。而且，我的原代细胞本身是半悬浮半贴壁的不太好养，又容易集聚成团生长，所以消化的时间很长。不知道有没有影响

wzkcc

黑胶虫是什么东西？？

hjqincc

3# zpzp0312
" H$ c: u  W8 ]+ I; A" G3 [- x

4 ?, ?, C! M' o& N0 w! `: a的确，尤其实验室细胞很多种，干细胞相对易污染。但只有我自己养干细胞，每次都担惊受怕的被污染呵呵

sailboat

常见的污染如下：
% y8 P3 K: ^. F7 A/ m7 \7 g1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。: a7 [% I1 t/ o5 m: z
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！; s  h) N8 y) q
可在培养液中加相应的抗生素处理5 W$ \" i$ m* w! G$ x7 U7 }& Y/ f
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2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，  l& O3 o& H2 X2 r" I
用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
0 Y" M" i4 E, m9 |) xCO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。0 v4 s$ n$ `' R2 a( Y' U
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。( B! `  J, a3 Z% G& M- x' ]2 k
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作 $ [3 Q' `; J1 x

% v6 ]3 R. o, u- e. [3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
7 i+ \, |+ J. Y0 l' }. f* s用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。
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4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。5 @9 |0 D) M) d" ]2 Z& x% c4 W# T

0 ?8 Z; U. t3 Q- z/ l+ \& f+ \5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。7 T) J- i3 D  B( s9 ?: K

" }8 z! P; s4 W6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。, i' ~- R8 l; w2 d

+ B& N- E7 c5 d3 `1 J污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等+ i$ j& o2 g0 e
关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长 就是操作的问题。
) v( j  h* V) v+ G- E也可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。
% C* j* \! W; Y* @" ]4 S; V; t/ N, Y& o2 @+ F
1、孵箱应定期用三氧机消毒 或者 紫外光照射，并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱同时孵箱内的水应是三蒸水
( a7 I6 }  k% t  A/ h1 F2、超净台\取材\器材\培养液\培养瓶\操作等因素
: E& Q3 O  c4 p( F. N3、超净台的风机不能过大，风机到6-8格。否则也可能能致霉菌污染
1 [- @& G  S/ z% }# G+ |# _( n# Z" {% g4、无菌室经甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水喷洒中和，约几小时即可进入操作。

flyingpnmc

我不认为是什么“黑胶虫”，谁也没见过“黑胶虫”。: W) u2 p2 P3 P
从你的描述来分析，我个人观点是细菌污染，细菌污染的主要表现是培养基变浑浊。我见过细胞污染后，培养6天才出现明显的培养基浑浊。估计是在分离细胞时带进的污染。

llingzu

xiexie