我最近也在做这个SP和ABCG2的课题，说些个人意见

细胞海洋

经版主xyzengh授权，转载其在丁香园发布一些文章，很有见地。希望大家积极参与讨论，交换意见。（xyzengh版主最近有点忙，由我代工转贴）
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以下正文：
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4 G; @* Z% G$ i/ V( C刚好我最近也在做这个SP和ABCG2的课题，说些个人意见，不对之处还请高手指点！
- a2 l; F' L1 }0 W# t( T用Hoechst染色来确定SP这个方法目前受到越来越多的挑战，当然，鄙人就是挑战者之一，呵呵！1。不是所有的干细胞都有所谓的SP的；二。不同的干细胞它所需要的染料浓度和染色时间都需要一一去摸索的，其中一个很重要的因素就是细胞中ABCG2/abcg2等ABC transporter superfamily members的表达高低，楼上的我如果没记错的话应该是针对小鼠骨髓干细胞分选的protocol,但不代表一样就可以用于别的所有细胞，呵呵。3。能够拒染Hoechst染料的不一定就是所谓的SP，同样种类的细胞在不同发育阶段对Hoechst的拒染情况也不一样，在网上搜搜可以发现相关文章，我相信不久你还会发现更多的文章。最后，如果真的对SP感兴趣，向你推荐两篇经典文献，前一篇是第一次发现SP的，后一篇是第一次阐述SP与abcg2的关系的，第一作者是中国人sheng zhou,还发了很多这方面的高水平文章。另外综述方面可以看看华盛顿大学的Qingcheng Mao写的几篇，这位老师看起来多年来一直专攻于abcg2啊，需要全文的话可以跟我联系！呵呵！) q+ |! @9 m; j7 K6 H
1 C( c' p4 F$ D  s- A
Goodell MA, Brose K, Paradis G, et al. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 1996;183:1797-1806.7 N& ]9 h3 s* ]7 S- J% a
Zhou S, Schuetz JD, Bunting KD, et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 2001;7:1028-1034.

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看了aaron928兄的见解受益匪浅，我也是初入sp细胞的研究，但不是主攻，且做的实验是肿瘤干细胞相关的，在肿瘤干细胞研究初期肿瘤细胞中的sp细胞是一个热门话题，它也是从一个方面（SP和ABCG2）说明了sp细胞中富集干细胞样的细胞，但仅仅这相信也不是放之四海而皆准的；同时近来肿瘤干细胞的鉴定更多是应用表面标志物结合相关功能实验来印证，如乳腺癌表面标志物CD44+/CD24-,结肠癌的是CD44+/EpCAM+/CD166+等等，所以前面研究的路漫漫其修远，望得到aaron928兄更多的指点迷津～～～

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呵呵，savager008过谦了，大家只是术业专攻不同而已，而我了解得也仅仅是冰山一角。虽然如我前面所说，SP分选及其与ABCG2的关系现在受到越来越多的挑战，但在干细胞领域，还是有很多人对其感兴趣的，今年的cell stem cell还有期特地为其开了个专刊。我在这边主要是做ABCG2/abcg2在不同物种不同组织细胞中的差异及其与所谓SP联系的研究，关于肿瘤干细胞了解得并不是很多，但正如你所说，肿瘤干细胞的鉴定更多是应用表面标志物结合相关功能实验来印证的，比如去年Harford Dr.Pier Paolo Pandolfi的group在Nature上发的一篇文章，就认为PML很可能是CML干细胞的一个特异性标记，我还跟他们进行过较长时间的交流和讨论，对他们的临床样本实验提出来疑问和建议，但，毫无疑问那是一篇肿瘤干细胞领域中非常漂亮的论文。然后往前推，2006年华人造血干细胞领域中的绝对大腕，Stowers的Linheng Li 和UCLA的Hong Wu合作在Nature上的那篇有名关于PTEN在造血干和白血病干中的作用和地位的paper至今还吸引着大量的眼球！接着Hong Wu又于去年在Nature上发了T(14;15)转位, c-myc overexpression,以及c-KitmidCD3+Lin- 在PTEN-null T-ALL白血病干细胞形成中的作用，看得我真是眼花缭乱，惊叹不已啊，呵呵！8 m: d& P, F# _5 K' j( |
然后回到ABCG2和SP的关系问题上来，现在仍有很多有趣的问题等待着我们去回答：2 _( h( H+ \8 d
1.表达ABCG2/abcg2的并不一定就是干细胞/SP，这点我想现在基本上是大家公认的了，比如其在人的trophoblast中的表达就很高，然而。。。可是做为一个相对保守的基因，为什么不同物种中的不同细胞中表达的差异会非常大？9 y7 D/ z$ m! z: Z3 d9 Y
2.为什么在小鼠胚胎发育过程中，blastcyst以前的阶段都能够被Hoechst染色（意味着abcg2表达相对较低），而在blastcyst期的inner cell mass却可以拒染（abcg2表达升高）？在2001年sheng zhou发的第一篇Nature Medicine上就提出了mES细胞abcg2表达较高，但与Hoechst拒染和SP分选没有必然联系？！
1 E( D# u$ l) {5 J' {3. 为什么在ABCG2/abcg2的表达与从骨髓或外周血分离出来的造血干细胞SP有关系，却与从脐血分离出来的造血干细胞SP无关？
/ P& f- O# o0 ?2 r关于这样的问题还有很多很多，以上只是我个人的粗鄙之见，我想版上比我在这方面精通得多的多的大有人在，还希望战友们不吝赐教，展开热烈讨论，必要的话还麻烦版主专开一个相关话题，呵呵！

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肿瘤中将SP细胞视为干细胞样细胞，估计是来源于C6胶质瘤的那片PNAS文章，此文中确实发现SP细胞具有很强的体内外克隆性、成瘤性、多样分化性。但近日浙大一院在cancer research发文，发现在功能上，大多数C6胶质瘤细胞具备干性，尽管他们即非sp也非cd133阳性。

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标记物挑选肿瘤干细胞不科学, p& a/ b/ f- O+ N. ]+ n  q
最准确的还是从功能上考察其自我更新、多向分化和成瘤性

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赞同kejia0422战友的观点，不管是胚胎/成体还是肿瘤干细胞，最准确的还应该是各种功能性的检测，而不是依靠标记物，就像ESC/iPSC鉴定的金标准是terotoma甚至是嵌合体的形成，而不仅仅是依靠几个IF染色的结果。可问题是，人们对于各种干细胞的认识和研究总有一个逐渐完善和深入的过程，在这个过程中，一个个所谓的特异性标记被发现出来（很大一部分又被后人给推翻），然后依据这些标记去分选研究相关干细胞或SP其他的特性，在这个认识初期的阶段，可能是一个不得不经历的过程，但随着认识的深入，越来越多，越来越细的标准将会被逐渐加入完善， 从古至今，社会和科学的推动和发展莫过于此，呵呵！

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各位大虾好 小妹最近也在用流式分选SP细胞 我们用肺癌细胞系做的 总是出不来典型的图 而且荧光染色强度很不均一 后来取小鼠股骨做了一次 基本上出来了 但是后来用细胞系还是做不出来 我用的是细胞系是肺癌SP-C 已经做了好几个月来 不出结果 万分着急啊
4 ~" N+ v% @% g! q我的步骤：6 A; u& Q& h& U( O- s2 s
1.0.25%胰酶-0.02%EDTA消化细胞
8 N9 n! T! U" y+ z3 }2.终止消化 离心
$ T8 ?. ^( `+ y( H2 Y2 z. Z& E3.将细胞重悬于37度预热的2%FCS+10mMHEPES的DMEM培养液中，调整细胞浓度106/ml
( b, e0 r5 P* R! E# _3 V4.对照组加入50 umol/L 维拉帕米5 E) i2 B! [5 J) p: R& Z5 N
5.10min后 两组避光加入5ug/ml的hoechst 37度孵育90分钟 每隔隔15分钟振荡一次# t- K) g+ ^: U. m5 Y) j/ i; x
（孵育是在孵箱中进行的）
) N% D, P* _% S, o, W6.孵育结束 4度离心1000转*10min（后面操作均在冰上进行）9 K2 n: ?. W6 J) i- j) ^0 y
7.将细胞重悬于冰的2%FCS+10mMHEPES的Hanks液中8 B0 a" y% ?& ?3 [2 o  d5 _$ `% R
8.滤网过滤 上机6 n+ O! _) K, d# D
请大家帮忙分析一下 万分感激
5 I+ M! L/ S& o( c* GPS：之前细胞培养于玻璃瓶，后来改用塑料平皿培养，结果比以前明显进步 但是还是没有典型的拖尾的图

饶冠华

呵呵  大家都对ABC家族的研究感兴趣吗？ 我这儿有一篇综述，介绍ABCG和ABCB在human multidrug resistance的作用." L: y8 O! g6 E1 m" a( O+ y( L
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xyzengh

很好的综述，学习了，谢谢饶版！我也献上几篇review,希望大家感兴趣，呵呵！[local]1[/local]