人外周血分离出内皮祖细胞的培养

大头娃娃宝宝

抽取外周血3 ml ,抗凝,血标本用PBS 液2 倍稀释,取3ml(稀释后血液的1/2 体积)的淋巴细胞分离液，加入一个新的离心管。用滴管吸取稀释后的血液样品，沿管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，勿打乱液层界面。盖好盖子，用封口膜封好，2000rpm/min 离心30min。离心后管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆。血浆层与分离液之间是一薄层较致密的白色雾状层，含单个核细胞（包括淋巴细胞和单核粒细胞）。用吸管小心并直接插入到单个核细胞层并吸取白色雾状层，收集到另一试管中。加10ml 生理盐水稀释分离的淋巴细胞，2500 rpm/min,离心10min,弃上清。重复洗涤1-2 次，除去血小板和抗凝物质，细胞计数，用RPMI1640 培养基调细胞数至2×106 个\ml，移至6 孔板（或细胞培养瓶）中培养（竖立培养）加入10%胎牛血清、1%IL-2（20ul\ml ）、1%双抗（青霉素和链霉素），摇匀。5%CO2 培养箱37℃培养。+ u1 J2 N: w7 {, s- w# V# b/ l
这是我准备做的试验 最后分离出单个核细胞后通过1640培养 然后加入抗体，流式检测。但是老师说怕分离不出有2×106 个\ml的细胞，无法上流式检测，因为我分出的是原代细胞，一般长不快，
9 G6 b* x& J6 n" D  那我要怎么做才能达到进行流式检测的条件呢？

baichunyu

1# 大头娃娃宝宝
% f" }1 P5 D. i% D6 o4 D第一，流式检测不知你是分选还是分析纯度鉴定？都需要一定浓度才行，即达到一定的细胞数量，这是你老师说不行的原因之一吧！
) D! P. j1 \5 Q1 F第二，实验步骤参考别人的可以但要自己仔细琢磨，分离液分离吸取细胞后建议用培养基稀释清洗，清洗离心次数越少对细胞伤害越少。
3 @6 j0 ~* V& @  u7 e第三，关于培养基，你选择1640，都需要加什么因子，这是最主要的，选择1640的根据是必须的，一定要考证清楚。

大头娃娃宝宝

我就是想通过流式检测内皮祖细胞的数量 关键是怕细胞数不够，上不了机啊
" ]/ K) g* \2 E" ?7 T版主有这方面的指导吗？

饶冠华

这种内皮祖细胞好不好养 你试验的最终目的是什么？ 题目和内容不符   看不懂  请说清楚你的实验目的 是到底为了做流式而细胞培养呢  还是为了细胞培养而做流式？

大头娃娃宝宝

不做细胞培养 为了在流式上检测外周血内皮祖细胞的数量。
  |4 L& f" P- ]5 P$ {  f- s过程是：分离外周血的单个核细胞，加入抗体（CD34 CD133 KDR) ,流式细胞仪检测EPCs数量。
8 ]) L' X( n$ n. m0 I8 J关键是现在不知道分离出的单个核细胞数量能不能达到上流式细胞仪检测的标准。因为流式细胞仪检测细胞数量必须多。7 |( T( Q& W- [  b
不知哪位有做过或知道的传授下经验。急！

大头娃娃宝宝

哪个1640培养基基本上只是保持细胞存活，细胞不怎么会生长。

baichunyu

6# 大头娃娃宝宝
: M" M& \5 e3 o1 x7 s6 v6 [; Z& m* n+ C1 M& x, S
要是这样，只单单要测个数量，最少也要20000细胞，想达到测量的计划只有多采点血液了。血液量大了，分离到的细胞就多了。我只想到这个办法了

大头娃娃宝宝

10ML血够吗？
! g' W; D+ Y  [1 w; u$ i再多的话我怕病人发飙啊

baichunyu

8# 大头娃娃宝宝 ; B' r2 j4 o# J2 Y* _" C( j! F

5 M( s* T& d4 E8 Y8 q' u只能看看了  或者现在有一种仪器，可以精确的计算细胞的数量

parcuezhang

我最近看了国外的一个视频，培养EPC的，他们只抽了4ML的外周血就可以了，不过他们的培养基是EGM-2(10%pHPL)。另外，要选年轻的病人，年龄大的外周血干细胞很少的。