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制备CIK首先进行分离淋巴细胞，分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。现在大多数用的密度梯度离心法。一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。0 y" |/ \3 Y# m0 P3 j/ X" h3 h
一些经验. o- H, u2 o- @& i- S# d4 O3 r
1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释
- }: }7 d7 z9 M8 S6 B3 l2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！）" n9 f1 D/ ^% z, g- H, J5 r3 `8 [9 K
3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。
. A- D0 ~& t* ]% m4. 离心 .转速 ：1500/分 8 f+ W V1 h5 Y; g
温度20c －28c5 x% Q5 v1 G( v3 u2 c2 k- S, _+ D
时间：20分钟4 i& H' c) B5 ~$ ^
no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞 层又弄混了，加速度也最好不要太大)
2 a4 \& }; l3 q5 J$ v" P1 ]3 c! h$ \5。取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞
4 K% F* b8 n- `: ^% s% l& Q6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！7 I( P. e* e% t, O& b7 @) f! V
7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。还有办法的。9 i% p" o2 c* @- s" i: Q, v$ z
8 离心。 转速：2000－2300/分 （转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！)' i; J, b/ k- c
时间：10分钟
4 v6 B4 c( Q, _, k; w" h温度：4c
! W# p9 m, U, b0 s+ b$ z9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你）
; |0 E x% G2 |) K10.细胞计数＋洗涤细胞。刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。这样是不是很节省时间？？- t* @& M9 R A) C
11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形.7 g" N( s2 F) _) q" A
a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）& d8 j+ E. c% W' L8 I
b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞* f S! S# r" _1 z! I; A' x: Z$ }
c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。总共数4大正方形
9 r6 r' u+ v! z( p! ?' ld.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度
* J* ~4 Z: ?& H% b) w9 _( xe 细胞总数是：细胞浓度x1ml（现在知道为什么重悬到1ml了吧？）; W+ @3 @+ i* S6 C. p P/ h
12.培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。加入rIL-2& t. k) z9 A3 R+ D+ h
25－50u/孔后，放入培养箱. |
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发表于 2010-11-27 08:14
