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器材与试剂, N; {) p1 i. W" c0 a P
6 u! R! N( N* M, Q) ? C6 |干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。
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具体步骤, [7 O G. b' ^
; ]) r2 Y7 ~# s: ^2 z一. 水的制备; {1 v' ~4 R1 `1 c e& l
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细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水
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& p7 G$ h4 p* f' V: b7 z二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)
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1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。$ Z4 L$ m! q: g5 U
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2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
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三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒
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胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。0 T2 I! J$ F) ]4 O' R- \
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1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25%，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。
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) e2 E. R: k# M, i% l) k6 Z2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。. O/ w6 X; i' s# l) Y( B. h" ?, _
2 d! ^3 t$ G5 H3 H四.青、链霉素溶液的配制与消毒0 C/ j k& x' ^0 m" M2 t+ _" u
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1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。- c: y) {: I+ T1 n% F, m* m( ~5 b, q
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2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。
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3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克？% s4 z6 [8 \9 \7 R
; S' e% |5 e( ~9 I五.RPMI1640的制备与消毒：- H3 _5 ?- D; E. g
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1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。
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2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
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- h3 E1 e/ q- \% ]3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。! _; w" S' v' t' {( x4 _
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4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。& G: \! Q2 F1 h( x3 I0 h) G
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5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。
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7 @ ^) ^5 D' L* K0 H六．血清的灭活
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6 R1 N6 J5 Z/ r! E" F) y细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。7 f+ ~# Y0 G8 b4 D3 y# e+ ~7 |
, l5 E! c J, s- I+ Q' i9 {七.HEPES溶液8 Q, J7 {7 u1 |
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HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
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1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：
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准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。
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, ?5 D1 X% K+ F( b2 |" N9 V$ f4 r; P注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。
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8 S6 Y8 m0 e3 ~5 R0 e. v) [ l0 q八.谷氨酰胺) ^* k/ c0 d% c3 E- Y
4 j. C' Z. n2 L7 p- _9 @合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50%，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。+ u1 x7 J* }( G0 ]
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一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。2 U6 T2 m7 T5 D" F
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九.肝素溶液的配制：
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o0 j1 @5 O* y7 y: h w2 i8 [含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为¬¬ ℃ 。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。! S3 c }% H0 S+ B
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十. Ⅰ型胶原酶：
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w) U4 Q. V. r: C0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。
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; w# H+ i5 f% q; K) I& f \十一.明胶溶液：
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. U) s! I) J( n* S因为明胶难于过滤，所以配制0.1％明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中，4℃保存。- v/ X: _* i2 F& `
* y, x4 K$ n& L0 Y/ [注意事项：1 [& Q2 Y1 R% \% d/ L% U: `
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1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
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) S. j D& a9 B' f t4 q2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米 和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。
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3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。 |
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发表于 2009-11-2 08:59
