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jucin

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发表于 2009-11-13 15:29 |显示全部帖子

小鼠胚胎成纤维细胞的富集
1 H4 y- S4 ^! Q
1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。
% S* q4 {' h: u* T7 v  d6 ^
2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。3 @# m5 K/ @# q

3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。
" }( j4 ~6 P0 o, X& j
4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。$ w* o5 P+ s& |
3 S; p  K: f% I
5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。

6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。# d; j, P1 n& h+ i) w( K1 g
1 s2 [* m0 S4 W9 @' ^% e
7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。$ T' V. N1 T7 H/ E4 D9 @
" \% k3 x/ w2 s* h- @8 ]
8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。3 R) W2 o0 I$ D5 v+ ~
/ m4 c) Y; ~  X: X- m/ p) f
9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。
. D' @. M+ R- l" ~. T  d2 t
10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。* s8 `2 U; j) D3 E# N* P* t

11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。
8 q! |5 X& n4 o8 f3 m- C
12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
8 X/ s% ^5 O. N6 [0 A5 \
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。
4 @. ?- s  A2 c4 \; w- M' y
注释：, ]8 |/ T& k3 q
. v4 m9 f4 i; O" {
我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。3 T& X9 W, j( k& X; l: ]5 C# u
( q9 J8 G) ?3 P4 x/ w
培养基成分：

88％ DMEM
  |. ^! t) G6 `. g
10％ FBS( l. g+ a7 U9 D! O+ {. T
! I: P# b' M3 R: E/ `# y6 L- A5 x
1％  NEAA4 W9 O  r3 c8 M: q" E# S: ~0 |1 f" H

1% 双抗
- q/ {- O- l0 N% @# ~+ B7 L( P+ Q
对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。0 L. e: x7 G# C. G8 ?# O. b

小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代8 p$ T" M0 I4 o# W9 ~( ?" ?
& y8 X, s2 D2 v  l  f' O+ }6 k' D
1、移去MEF培养基, Z+ d" E* j) D
, a9 i; D, Q. J0 g/ r
2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。

3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。

4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。# t% s; ]# j- A
% C- Z: p1 X0 @" x1 f
5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。. ^! O5 z9 ^+ b) Y9 \- ]* b
4 f& s$ T7 E, {& [: U
6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。
. W; K$ w$ P2 y* l' k- ]
7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。7 n+ L; p- ?) e' v3 V

8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。8 t* N4 f1 [* H3 n3 x( x. l. W3 d
0 A# v5 d. s5 v% X: o2 P
注释：
6 m5 z7 t, G+ l! k' m. q/ m; N
MEF培养基成分：1 X+ W1 h) ]. w

89% DMEM (Gibco # 12100-046)
( |  }+ d8 `8 h
10% FBS (Gibco # 16000-044), D: Q# h$ F$ ?& Z

1%  NEAA (Gibco # 11140-050)
" s6 X! K; H% A: h3 a$ A
MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。" E, g% `& X3 [- [! p
9 o$ ?1 e5 x3 e) e* D1 X- B; Z
小鼠胚胎成纤维细胞的冻存. A5 e( n# d# @2 F

重悬培养基：
0 z0 Y; k, ~8 E3 H+ j; k
80% DMEM

20% FBS

1%  NEAA6 ~4 r# V2 M' l) y; L$ O: U
$ q  {' i  W, ?+ i
冻存培养基：
7 N' g/ V3 l* v4 P% B
60％ DMEM+ F$ n/ E  V) g8 B- n- t" H

30％ FBS  p  |1 M" p& X) O
0 u5 P# V* d" s$ s" |* S: ?
20％ DMSO
9 Y7 d  P2 v" {9 S4 O
1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。

2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。

3、将细胞吹打下来。$ a$ q1 Y. h* n( W3 P
+ X# b' T8 T% p0 e
4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。
' j2 [' m: a' k
5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。) I& L$ u& o( x! }1 p' g4 J

6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。! h/ P5 ]! U4 \2 |

7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。) Y" U) M& |& Q% A9 f/ E
2 t( X/ w/ e7 F& Z
8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10％。
+ F, i$ P4 \6 o9 B# w
9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。; |8 x/ F% s" _* O5 D& S

10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下）
+ F$ t, `( r) ]! o. K8 i* ?
11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。
/ u* k5 a1 P0 G" m; ?  B
注释：2 q& i7 ^0 ^) j& k3 H

提前标注好冻存细胞的以下信息：+ U) I" S' p9 N
( {2 p( X) N$ R7 J: |
细胞系名称" M) j0 R$ ], p* p, J7 ?
% ^$ \  b# b- z( O4 e5 t2 Z' g
传代的代数
3 R% y3 W, k. z. [. R5 B
冻存细胞的数目9 e" B% O. W. R, ~

日期
9 E( I) Q! m# G. J
Initials- I' y8 y4 S7 w. ^4 W& n, ^0 C

注明冻存/解冻形式- _3 G; M3 z( G  d
" W$ [9 {  K% D' j2 n0 }# y( f. B; |1 ]
小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏
3 t) |* ]& p0 H1 G
1、将冻存瓶从液氮中取出。

2、放在37℃水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.+ z; M8 u0 M. ?, `0 z6 K, R

3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）
/ @6 w: K6 c0 p+ x. v& o
4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。! F0 y% e" F) T* h
+ v" k: i$ q5 p; H- A
5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。5 K% \* B5 W) H6 @7 p
* n" h) B7 F8 {3 s
6、1000rpm离心5min。

7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。$ s& O; G& y4 F* ^; \9 g6 d

8、放入37℃培养箱。
- A# v/ ]! c- C1 f8 M- F" Q
9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。
# g" c9 _5 p! _9 J' ]2 x" r6 x
网友观点是：2 h- J& e' f5 V9 i2 {; r

1、关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。3 V( [: P1 C/ L% t6 U

2、关于提取MEF的比较好的protocol
. ?0 i. R- O" U3 N
3、关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。, q7 K2 @' `: S# j9 G3 S9 i

4、关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的 AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：5 \8 F9 e9 U1 R0 i! h% ]' W

（1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。' B. y1 T- W* T- G- [& U% {
- o& ^) \" g0 `5 s" ]
（2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。. X5 A! _- S' t- }$ \0 H: ]7 C! ~

（3）现在的分离MEF的方法很便宜，不复杂，而分离纯的免疫细胞（如NK，DC），需要MACS，FACS等，这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说，不是很划算。因此除非是需要研究某一种免疫细胞，如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因，或者蛋白，或者某一信号通路等的作用，MEF 细胞不失为一种选择。
: ~0 ~6 h: `6 O0 G' V, f+ ^+ @
网友观点：$ F1 H+ T' H+ l+ J: H4 y
/ W+ G9 Z6 f" x: }4 P# z4 w
1、我每次取的是16~18天的胚鼠个人觉得无碍我倒更喜欢大一点的胚胎更好操作一点 . \) S  ~3 w/ e& d1 c
# E% }0 ?2 M2 e$ I$ x2 s
2、我取的是皮肤然后胰酶4度消化过夜第二天终止消化撕掉表皮留下真皮减碎用的100目滤网过滤这个胰酶消化的时间是个关键时间长了细胞容易死时间少了，表皮不容易揭下来我有此就是这样消化了15个小时结果接种下来的细胞不能贴壁全死了2 ]/ g9 B1 |4 Q2 K
8 L$ L5 V% v5 y9 L1 ]# P! ]3 \4 U
3、我用的培养液是DMEM+10%小牛血清培养液也是关键因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣但总归是原代可能还是比较娇嫩我前几天就是这样后来发现是培养液出的问题测的PH值都8.3了细胞不死才怪毕竟细胞耐酸不耐碱

4、原代培养的最大天敌还是污染

网友观点：
7 b) |) a" I/ v! C5 P
MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是16.66666%。

网友观点：

细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3传代，3代之后细胞就出现衰老了，我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比，细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。一般在4×下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。细胞铺展很厉害，细胞的透光效果增加，说明开始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做转染或是感染的话，出现衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以内做。

我们用的就是WiCell的protocal养，和前面那位战友发的差不多。只是我们用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我觉得最重要的就是种盘后的换液。原代2小时不管还有多少米贴都不要，传代复苏后一小时就换。消化的时候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下来的也统统不要。因为健康的MEF就是易消化易贴壁。老化以及混杂的其他细胞（神经、上皮）就没那么快了。, c2 f1 t/ p7 E+ i

附带一句，易消化易贴壁是fibroblast的共性。

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