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fish619

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发表于 2010-1-7 23:51 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

骨髓间充质干细胞经验总结，转自丁香园论坛:; v+ T0 v/ \0 U  I6 x) \; M

            一、骨髓间充质干细胞的分离

骨髓原始间充质干细胞是骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血。目前常用的分离MSC的方法主要有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞在低血清培养基种有贴壁优势特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化及扩增MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中各细胞成分比重的不同，分离单核细胞进行贴壁培养。二者本质上无多大区别。随着对MSC表面抗原认识的深入，又有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之成本较高和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。& c6 M# j/ T7 v' @
1．直接培养法（全骨髓培养法）
1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。
  culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。+ r* L  S! `! E3 C0 F
  布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：, E0 D9 i  q9 L; X% ]
   （1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞  A& P1 ?* m) m8 b4 D- g' g$ P
   （2）原代培养24h,48h各换液一次
   （3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来
   （4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。
   （5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。! e% F0 Y  I: }. \1 L2 N4 F. r' s
   （6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。
菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48h~72h后首次换液，一般7~10天可传代。1 Y+ k; D) m! o/ k! }& _' Q, W
天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48h后去悬浮，尽量洗干净，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。) S  M& q" n% q- h) l8 w1 C9 h
   2.  密度梯度离心法* Y9 d1 a+ ~3 ~% b! Y6 A
裴雪涛等用比重为1.073g/ml的percoll分离（400g×20min）人骨髓MSCs，取界面处细胞层，离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种，72h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每3d换液一次。细胞长到80％汇合时1：1传代。
菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时，用2400rpm×20mins后可见中间有一层约1～2mm厚的白色层，仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs，。4 B' E% |- D/ g. N% N: s# p
周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs，500g×30min离心后，取中间的单个核细胞层，PBS洗两次，接种于IMDM培养基，1d后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3-4天换液。
jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错，当然所获细胞群的纯度不一，Percoll最纯，而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀（35 PASSAGE）。
本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分离得到的细胞较为均一，多能分化性和增殖力不如贴壁培养的，尤其是增殖力相差很远，有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。
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二、骨髓间充质干细胞的培养

天之饺子认为，间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。
分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。

三、骨髓间充质干细胞的特性; I, ?3 M0 e6 p; f8 K$ ^

体外培养的MSC体积小（但物种之间有差异），成梭形或多角型，核浆比大。多位平行排列生长或漩涡状生长。在细胞生长的对数期，间充质干细胞的倍增时间约为30小时。不表达分化相关的细胞标志Lin－，如CD14，CD19，CD34，CD38，CD45，CD56等造血系标志，此外如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin；但间质干特异性表达表达SH2、SH3和SH4。间质干还表达STRO-1、CD29、CD44、FIK1、CD105、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面抗原。这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95％和98％。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自发分化，在体外特定的诱导条件下，MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。
四、其他相关内容
Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离出多潜能的间充质干细胞（CD45－TER119－），为多潜能成体干细胞的一种，他们证明，MAPC高表达端粒酶，而且随着细胞的扩增，端粒的长度不变，单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化，而且能在体内能够向各种组织细胞分化，相比较而言，形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。+ R$ k  O# w8 f. ?! X( e
4 S) C6 S3 F0 m+ s( L) Q9 @
***  在cells主任的热心帮助下，再加上兔和猪的间质干的分离与培养方法。
兔骨髓间质干细胞的体外分离与培养2 @3 t$ T& W# b2 l* A

按Kadiyala 等描述的方法进行。5 月龄的本大耳白兔, 雌雄不限, 18 号针头或骨髓穿刺针接10 m l 注射器, 注射器内含稀释的肝素钠3 000 U0. 2 m l。从髂后上棘或胫骨近端内侧穿刺, 抽取骨髓液3～ 4 m l, 缓慢注入预先加入4 m l 淋巴细胞分层液的试管内, 密度梯度离心, 2 000 r/m in, 20 分钟,吸取中间的单个核细胞层, PBS 洗2 次, 以1. 6×104/cm 2 的浓度接种于100 mm 培养皿内, 加15 m lHam ’s F12 培养液(含青霉素钠100 Uöm l, 链霉素100 ug/m l, 两性霉素B 0. 25 ug/m l) , 加入胎牛血清终浓度为10%。在5% CO 2 孵箱内37℃培养4 天。更换培养液时将未贴壁的细胞全部弃掉, 继续培养且每周换液两次。12～ 14 天后基本长满单层, 用0.25% 胰酶含0. 5 mmo l EDTA 消化5 分钟, 即得到原代骨髓间质干细胞悬液。再以8×103/cm 2 的细胞浓度传代培养,并用于实验。
Kadiyala S, Young RG, Th iede MA , et al. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. Cell T ransp lant, 1997; 6: 125

猪骨髓间充质干细胞的体外分离培养
从成年健康小型香猪髂骨抽取骨髓, F 12 培养基(Hyclone,U SA ) 在无菌条件下充分混匀, 加入到密度为10.77 g/L 的F ico llPaque 分离液(Pharm acia, U SA ) 中, 400 g 离心30 m in, 收集单核细胞层后, 并以F 12 洗涤2 次。置沉淀细胞入F 12 培养液(含质量分数为10% 的3 S& p7 |2 ^5 ~7 C2 P
胎牛血清, 100×104 UöL 青霉素, 100 m g/L 链霉素) 中, 计数细胞, 调整密度按1×109/L 的密度接种, 37 ℃、体积分数为5% 的CO 2, 在饱合湿度的CO 2 孵箱中培养,24 h 后更换培养液, 弃去未贴壁的细胞, 每隔3～4 d进行换液, 倒置显微镜下(L eica, Germ any) 监视细胞生长情况, 接近融合的M SCs 用质量分数为0125% 的胰酶(Sigm a) 室温消化5～ 10 m in, 180 g离心10 m in, 弃上清, 按1∶3 比例传代培养, 留取第三代备用。
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方利君, 付小兵, 孙同柱, 李建福, 程　飚, 王玉新.猪骨髓间质干细胞的分离培养及分化潜能的鉴定.中国危重病急救医学.2003,Vo l. 15,No110! u6 \& C7 C+ E' t5 p7 P

***  在ouyh118的帮助下，补充犬MSC的分离与培养
  可采取骨髓穿刺的办法获取骨髓，应用培养基洗涤后，再用percoll进行密度梯度离心，得细胞进行接种。培养基本人选择DMEM-L,血清浓度10％。大概7－10d即可confluence,接着就可passage了。比例为1：3。其增殖速度很快，我得一般约2d传一代。

大鼠BMSCs的培养我摘录布兰卡大虾的经验与大家分享：
用全骨髓培养法。
1、取6w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓。一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。
2、冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。
间质干呈梭型或多角型克隆样生长。传代后好像较容易分化。宜用原代。& _/ f  s! O* J* ~

大鼠长骨两头是骨髓细胞丰富之处，可在中间剪开，由髓腔向内反复冲洗，使骨髓液倒流出来，然后再剪开骨端头部，仔细冲洗7 B* X5 ~7 @9 Y8 b
2.操作过程可消毒一套器械、无菌碗、无菌巾，在操作台内铺一个无菌手术区，戴无菌手套操作( ]- Q; z" j& ~% y; `* h0 @
3.可以使用进口的塑料培养瓶，或者用0.1％明胶包被玻璃培养瓶后（要少量明胶浸泡瓶底30分钟，倒掉多余明胶，37度或自然干燥，可在无菌台里敞开口自然风干）  N# q9 F8 D( J8 G7 J& X
4.原代时死细胞不可怕，MSC很少，先死掉的多是杂细胞，耐心点，注意观察贴壁规则的细胞克隆的形成
5.第一次换液不要太早，如果采取早期贴壁分离，可在接种4h后（我用1h也很好）倒掉培养液（包括细胞，因为MSC已经贴壁了，尽管你看不见典型形态），换液后静置3－4天在半量换液
6.耐心哟，要等10多天，这个东东很慢的