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本帖最后由 细胞海洋 于 2010-8-21 21:45 编辑 2 p$ R, p" c4 e
: k. f/ n! H. ]! D4 x
细胞膜片的形成
! o- _0 E3 L0 T2 R( X, x* E将分离培养的毛囊干细胞接种于饲养层细胞
+ }1 K8 \8 q( j# M0 `4 L(3T3细胞),加入FAD条件培养液,每三天换液一& x4 Z4 y. b; O; K- O
次,生长至克隆汇合后,培养皿中加入中性蛋白酶
( x1 F K4 r" G5 S" \7 b; q0 L2 ml,5 min后用显微镊子将细胞膜片从培养皿表面( U, e7 A9 O5 W/ b2 X
轻轻剥离下来。
# J9 l& }+ H8 Y# V0 m细胞膜片的检测9 A8 Z: `" q1 r7 }0 A, F5 L1 N' k/ v/ J
将体外培养的细胞膜片经PBS冲洗2次后,2%8 n8 h/ I' W1 b, J( L/ Q5 y
戊二醛磷酸缓冲液固定,4℃保存。检测前PBS冲( n8 Q2 D" j8 s- r9 L
洗,1%锇酸固定,梯度乙醇脱水,醋酸异戊酯置换,/ y# |: e/ x8 D; {1 @) P3 ^. h
CO2临界点干燥,离子喷射仪喷金,扫描电镜观察。
# x, r# {/ W' @将细胞膜片石蜡包埋,检测前脱蜡及水化:切片, z2 P2 ?- `: a6 `! c+ }. b
依次经过二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脱蜡,100%、95%、85%、" p5 q2 R) X6 U+ H' o5 w
70%乙醇rpm水化;PBS漂洗5次,每次2 min;滴加. {# R$ g* a, v6 A. ]7 ~* X% @5 X
3%H2O2置于湿盒内37℃30 min;PBS漂洗2次，每次3 min;0.25%胰酶消化,37℃30 min;PBS漂洗7 }' o4 d% X8 F9 t) s
2次,每次3 min;清除非特异性染色,滴加10%羊+ p: U5 i8 T) k
血清,置于湿盒内37℃30 min;吸去羊血清,擦干;
& q. S, }9 d$ H滴加鼠抗人单克隆抗体K15,外皮蛋白工作浓度6 _# B% z" S. e8 s4 r
均为1∶100,置湿盒内4℃过夜;第二天PBS振洗
; |: K( c% f7 q' B3次,每次3 min;滴加二抗生物素化羊抗鼠IgG;7 B4 v2 p q r6 _/ m& Z7 D
PBS漂洗3次,每次3 min;DAB(1∶50)显色10 min;- X& [ d! Y$ }8 m W0 h
水洗5 min,细胞核衬染,苏木素染色2 min,自来水& h0 n( l3 a4 J9 O/ s6 o
洗,迅速过盐酸乙醇分化,自来水冲洗;梯度乙醇脱
& W& n6 j# f) Y: c7 q' @8 ]水,二甲苯透明,中性树脂封片。 |
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发表于 2010-1-26 17:26
发表于 2010-1-26 19:43
