人骨髓间充质干细胞的分离培养，请大家多多赐教！

云水缥缈

取骨髓血，密度梯度离心和贴壁联合培养法培养原代细胞，培养基为10%胎牛血清的IMDM（GIBCO)，购干粉自己配置，胎牛血清是NQBB的100ml装，淋巴细胞分离液用的是GE的ficoll，用的是塑料培养瓶，已经培养了近两个月，原代细胞一般状态还可以，传代后状态明显变差，即使原代状态非常好的也是如此，感觉还有老化的趋势，年老供体更是难养！时间长了感觉细胞分化了，出现空泡样的的细胞！有的细胞根本养不到传代的密度！ 大家有没有这方面的经验，我用的材料是否有问题？请大家赐教！等哪天我把照片传上来！

angel-sakura

密度梯度离心？我们这一般是用全骨髓法，密度梯度离心在国内一般比较难得到状态好的细胞，具体我也不太清楚，我们这单用全骨髓法得到的细胞蛮好的~~

ziyunfei1982

应该是全骨髓贴壁培养好养，Nature protocol 里有详细的操作步骤，很好养。淋巴细胞分离液不好，操作时间长会死很多细胞。细胞成分太单一，增殖就很慢。贴壁了以后再传代纯化。我们用低糖DMEM，加10%胎牛血清。细胞状态很好

ziyunfei1982

我们养的，较纯化的

ziyunfei1982

个人感觉玻璃瓶比塑料瓶好

hawkyiger

养的脐带MSC也有类似情况，用的是DMEM-LG+10%FBS，现在正在尝试无血清培养基，可能会有一定的效果

云水缥缈

回复 2# angel-sakura
6 e, H6 S* s# f0 [9 s4 i  K4 ]4 M) B
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    我们用梯度离心原代培养有时候也还可以下面是培养一周的细胞照片

云水缥缈

回复 3# ziyunfei1982
2 [7 m' h* I  {+ p' B& [
& k/ K4 j+ ]6 P7 B# M' n
5 \$ r; ]9 h6 r6 Q6 r    梯度离心法，感觉早期细胞很多时候细胞分布不均匀，成团生长！细胞纯度还可以！只要换几次液后还可以了！传代后细胞状态差，是否跟胰酶里加了EDTA有关系？

云水缥缈

回复 5# ziyunfei1982
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0 a8 C2 O8 g# T# l0 ~' ?1 T5 S# m  ~: o  S& I0 J
    我用玻璃瓶和塑料瓶都养过，塑料瓶明显好！这也是国际公认的！

angel-sakura

回复 9# 云水缥缈
2 l! a, }1 _. v塑料的贴壁贴得好些，我们消化BMSC时不加EDTA，因为BMSC贴得不仅，加了反而长不好，你梯度离心法用的试剂是进口的吗？据说国外的基本是用这个方法，但国内好像试剂不行，用这个方法养不好