MSC的分离和鉴定

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1. MSCs的分离和原代培养:
9 G+ i4 W+ {0 ^3 y4 d取成 人 骨 髓3-5ml，用等量的不含钙镁的PBS洗涤，900X g 离心10min，弃
* @( r- t& `/ T去脂肪层及上清。沉淀用含10% PBS的DMEM-LG培养液重新混匀，缓慢加入到密度为1.07 7g/ml的Ficoll分离液上，900X g 离心20min，收集单个核细胞层，1 a: H; f/ W( A( i1 S
用PBS洗涤2-3次后，再用含10%FBS的DMEM-LG培养液重悬细胞并记数。调节# O5 o! j. s1 w4 f1 o" K* q
细胞密度至5 X l0'/ml，接种于底面积为25cmz的培养瓶中，放置于37'C, 5%CO,9 t5 |6 r' O1 R' p: m
培养箱内培养，48h后更换培养液，以后每隔3-4天换液一次。# i$ h" X$ B; o; z: I
2. MSCs的传代培养:
1 O$ k+ ]5 U4 ^% x  A3 Y( _( _4 R当原 代 培 养的细胞生长到培养瓶底的大约90%时，用消化液室温下消化0 \3 Q9 R3 a$ u
5min，加入含10%FBS的培养基中和胰蛋白酶的活性，用吸管轻轻吹打细胞，直到贴壁细胞悬浮。吸取细胞离心洗涤一次，再用10%FBS的DMEM-LG培养液重新悬浮细胞。按1:3进行传代培养，并记为P1。传代培养过程中隔日更换一次培养液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满整个培养瓶的底面。用消化液将贴壁细胞消化分离，按合适的接种密度进行下一代传代接种培养，记为P2，余类推4 G4 c; b2 s3 b) V
3. 成软骨细胞的诱导: g9 n1 V; m" a& n7 B
选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接
4 |+ Q7 M) g  i. j种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。% ~3 S9 P+ K' A- h( G# p! d
软骨细胞诱导液:4 M& A( ^; s, [& q3 r
DEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF
1 C& X' N: T, t4 b5 T  V6 j-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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1，骨髓血单个核细胞(MNC)的制备8 F" ]- K7 B+ I! c# u( z) o
①取骼后上脊骨髓血5ml(300U加1肝素抗凝)，加等量DMEM稀释。②取
5 a2 S9 o% {( a15ml 离心管两支，各加淋巴细胞分离液5ml，吸取已稀释的骨髓血沿管壁缓9 s: r1 p; A+ {# @3 i8 i
慢加于淋巴细胞分离液面上。③25℃，2500rpm，离心20 min。④吸除表面
5 S0 z! X; Q/ `4 t% P. K的脂肪细胞层，吸取交界面(上层血浆、下层为淋巴细胞分离液)云雾状单2 O3 `+ }5 t# _8 r" X& [
个核细胞层置于另一离心管中。⑤用PBS洗涤细胞3次(l000r/min、离心5
. j: R  [! U7 G5 W% _! xmin)，弃上清，试管底部细胞即为所需MNC，加入DMEM/F12完全培养基  N# {9 X8 Z; Y( R0 W0 e( m9 _
重悬，计数细胞数，调整细胞浓度。: x. z# R+ p0 n# O, O
2.骨髓间充质干细胞的培养
* L8 S' q# S. k' @* W骨髓 MNC以lxlo6/ml接种于25cm2培养瓶中，培养体系为5ml含10%FBs
" w3 q8 O. O! u/ X3 M- S的DMEM/F12完全培养基(含loU/ml青、链霉素)，置于37℃5%CO2饱和; D5 a* ^) U+ D' ]/ o0 [7 `: u
湿度细胞培养箱中培养。48小时后全量换液。6 P' |/ c: g( X
3.细胞的消化传代
& b1 U" W" ]: @* `! ^, ^9 c) n: T9 Y① 待MSCs生长至约80%融合时倒出培养液，PBS冲洗3次。②加入sml, _/ c5 X+ {4 m2 E
含0.01%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液置于室温下(气温低时放入37℃孵
- s' }- E7 S" h- w2 U$ n# ^箱中)。5mjn后即可见细胞胞质开始回缩和片状细胞浮起。③轻晃培养瓶，4 {( G' ~+ D6 P6 p- x8 Q, Q. A
加5ml含10%FBS的培养液中止消化。④反复吹打细胞使之绝大部分悬浮，8 n0 ?' ?: K% M' n
用PBS洗涤3次(1000r/mln、离心5min)。⑤加含10%FBS的完全培养基0 }) ~* y# }6 o5 s
分两瓶接种，传代比例为1:2。  W* ]2 j& H2 K
4.流式细胞仪检测MSCs表面标志
9 Q/ [0 E8 o/ f5 w取培 养 的 第2代MSCs。①倒出培养液，PBS洗涤3次。②加入消化酶消% s& E& ~0 L  t* a" ^
化5min后，加含10%FBS的培养液中止消化。③洗涤3次，尼龙纱布过滤。1 M' x. Q2 ?5 V5 {& g: x7 t$ _
④计数，分成每管sooul，细胞数约为lx105。⑤分别加入荧光(死、FITC、
5 x  z* K7 j. \7 B6PCS) 标记的小鼠抗人单抗(CD44、CD45;CD29、H工A.DR;CDI“、CD34;
2 c5 @. `5 M8 [& j& n9 jCDlos、H工A一DR)各10ul;对照组加IgGI。⑥室温、避光孵育30n后上
  b) }3 h, F. w0 f/ p机。⑦用分析软件进行流式细胞术分析。
& z4 B; R7 N; O! U5.体外诱导MSCs向神经细胞分化( Q5 e+ W; C" N* u5 Z
取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片
% A8 s8 i$ U7 ]: p. _( A* I的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs( e0 X; F8 f' k
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
' _! J; Z# ?9 I# }. }, G! p' H后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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成人BMSCs体外分离、培养，诱导分化方案：
0 S- V& D8 z) p; L4 _将临床上获取的人骨髓抽吸物和α-MEM培养液（1mL抽吸物：20mL培养液）吹打混匀后接种∅100mm培养皿；于37ºC、5%CO2培养箱中孵育培养，48h全量换液除去未贴壁的杂细胞，以后每3天全部换液一次；当细胞生长达85％汇合时，吸取原有培养液后用PBS清洗一次，再用0.25% Trypsin-EDTA消化2min左右，500g，5min室温离心收取细胞，用适量37℃新鲜培养液重悬后，细胞计数，按照2×105/cm2传代，成为第一代细胞(P1)；5 j. I. ?+ g* Q- q1 _
对各代细胞描绘生长曲线) i1 A) t. k3 {4 R; W/ d
选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化& }3 L( y1 u8 p$ ^; E0 _; X
成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。4 }9 ?9 C2 @( O4 A/ J4 ]# j8 b
茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。3 u, \/ ?4 f  c% O  y* Z6 t
* `9 X* _* a+ G- j* u2 R: v! O
成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。
& w" B; \1 @$ f9 [- E7 h& ]) [: B$ b油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。
* P0 _, }& e& h
: ^1 J% O# z5 P& T参考文献：
9 Z0 C% j/ C3 x8 t2 o7 Q[1]Mauney JR, Jaquiery C, Volloch V, Heberer M, Martin I, Kaplan DL. In vitro and in vivo evaluation of differentially demineralized cancellous bone scaffolds combined with human bone marrow stromal cells for tissue engineering. Biomaterials 2005, 26(16):3173–3185.7 P' H- W5 E; a4 k8 a
[2]Rowena McBeath, Dann M. Pirone, Celeste M. Nelson, et al. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Developmental Cell 2004, 6: 483-495.5 {& [! ~  i$ Y# G
[3]Carl A. Gregory, W. Grady Gunn,et al. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction. Analytical Biochemistry, 2004, 329:77-84.* F, J3 S, W4 x: f/ ~" S( h# ]
[4]Backesjo CM, Li Y, Lindgren U, et al. Activation of Sirt1 decreases adipocyte formation during osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells. J Bone Miner Res, 2006，21(7):993-1002.

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paulin98122:脐带MSC的体外分离，培养，向肝样细胞诱导分化) o1 D& z! Y. _( D& P5 q# q+ m3 x0 k
步骤：（首创，但已有人报道）
9 u& H( B% `3 X/ `" J1. 医院收集新鲜脐带，立即分离（以下所有操作均为无菌条件）5 p1 E+ \5 ^1 h
2.PBS冲洗脐带两遍，去除血迹
/ F* `$ i( @4 e: ]3. 清洗后的脐带手术剪剪成1mm2大小的组织块，加入含10%FBS的DMEM，3 7℃，5% CO2 培养，三天换液一次. \. l/ H9 Z' r" I. M9 X( Q
4. 10天左右，成纤维样细胞开始贴壁 ，细胞数量足够后，PBS清洗去除组织块，细胞传代培养，培养条件同骨髓MSCs6 H6 L8 J1 V9 m$ _' \
5. 流式，成骨，成脂鉴定。- P- Q% v% ]8 p5 _
' H6 _- {; I5 Y1 x; L9 z
肝样细胞诱导分化[1~3]
& N# X+ D. e3 E& u3 ZDMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达! D( M0 ~' K# f" ^0 m
1 b6 \5 s- \" ]/ {4 E" i" s- m
1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097
3 J5 X8 ~$ t8 h: K2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.  u/ N3 Z* t, e: |0 G
Human mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation
* K8 J  h  c7 e! h# I" {into hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329, I& \4 n0 K% K9 ^) l
3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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shenjingren" D1 u1 V% E+ {
做干细胞的战友很多吧，我也是做过的，是SD大鼠的间充质干细胞，相信园子里面也有很多同道吧，下面就简单说两句。
2 I$ G" B7 ~1 J+ X1.SD大鼠骨髓MSCs（rMSCs）分离培养5 p) x& b. b4 ^# B2 v+ s4 H7 w
引颈法处死3-4周龄SD大鼠，于75%酒精中浸泡消毒1分钟，在超净工作台无菌条件下取出后肢股骨、胫骨于无菌PBS液中，去除附着组织，剪刀断开骨端，用10mL注射器从一端骨骺开口处，推入PBS液冲出骨髓，置于盛有完全培养液的无菌小烧杯中。全部冲出后，用尖头吸管轻轻反复吹打制成细胞悬液，收集细胞悬液入15ml消毒离心管，以900r/min低速离心10分钟，去除上清液，用DMEM低糖完全培养液将细胞密度调整至1×106/ml，接种于 25cm2的塑料培养瓶中，略旋松瓶口，放入CO2体积分数为5% 、37 ℃、饱和湿度的培养箱内，静置培养。3-4天全量换液一次。当原代培养的rMSCs贴壁细胞生长增殖至接近90%融合时，用约1ml左右的0.25%胰酶室温消化后，根据细胞生长的情况以1：2或1：3的比例接种传代，3-4天换液一次。此时的细胞为第一代细胞（P1），当细胞生长至90%融合时，用上述方法再传代，使细胞不断纯化和扩增。
5 y' ~* P8 F) x/ `& ]& ]2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
( r0 O' F9 G( e7 Y2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞) ?" z/ X- M; @; _, `1 j6 ]3 t2 \
以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。) D: U$ c! e+ i! S/ i. o
茜素红S染色法步骤：
% O7 \6 t0 D/ u  ?) q: W(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次7 k: y2 j- d# a8 Q3 x* G7 ~+ z+ }
(2)茜素红染2min。
# z# q* u6 y/ D2 {(3)蒸馏水洗5-10s。( `+ l2 X! a- c: \  U6 }, }# I
(4)分化液洗15s。
! v. n) w3 G, q# U, k4 {; p(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。  k& C7 |" X: ?) v1 N3 T
2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞
2 ^% V2 C1 @4 n6 A. z7 k/ r. u  h以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成
1 J8 F4 Q2 y8 @! F$ B油红O染色法步骤：
1 P9 v4 Z9 H  I# {9 F(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;, W" S% B/ n+ p
(2)4%多聚甲醛固定15 min;4 Z. p2 _* D' t% p9 [0 R! Y
(3)PBS漂洗两次，每次5min;8 T" {: w/ B$ D  C
(4)入60%异丙醇漂洗。# }0 p' {6 I. a/ r8 F
(5)入油红O染色15分钟。  E9 ^, `/ [- z* g. ]8 u
Devil60%异丙醇漂洗。( O; U4 F, K0 e) X

$ A4 d9 S0 Z% K: F7 Z' J, A8 x3.rMSCs成肌细胞诱导分化2 i. l" ~1 u+ z, g  {  ]1 n
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。$ K1 m+ X. L" H4 W6 K0 k' `( W
参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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barley: 成人脂肪间充质干细胞的分离和培养：
; l, R1 ?+ z% H! Q+ o! j) W% X成人脂肪组织取自吸脂手术患者,采用吸脂术采集出来的脂肪组织用D-Hank’s洗去血细胞和***，0.075%的Ⅰ型胶原酶37℃消化1小时，之后用 100目筛网过滤除去未消化的组织，1400转/分钟，室温离心10分钟，弃去上清，再用D-Hank’s重悬洗涤2遍（1200转/分钟，室温离心7分钟）以除去胶原酶，最后离心收集细胞。
8 S! U; N' t' R6 I成人骨髓间充质干细胞的分离：
0 v6 _& d8 M0 Z  h5 t) a; r6 f' E。无菌采集健康志愿者的骨髓5-10 ml于无菌的肝素管中，取一无菌的离心管，用D-Hank’s 液适当稀释骨髓后计数，并调整骨髓细胞浓度至107/ml。然后取一新的离心管，分别加入恢复至室温的Ficoll淋巴细胞分离液和上述骨髓细胞悬液，加入时仔细操作勿破坏界面, 二者的比例为1：1。然后再将上述离心管配平后放入常温台式离心机中，以1500转/分钟的速度离心20分钟。取出离心管后，无菌操作仔细吸取白膜层即获得了单个核细胞，将单个核细胞用D-Hank’s液洗涤两次（1200转/分钟，室温离心7分钟）并计数。
0 T  s9 ]9 F) e4 U间充质干细胞（MSC）的接种和扩增培养：
2 v; D+ p* t1 O/ |3 S细胞以2×106/ml的密度接种，37℃、5%CO2培养箱培养，2天后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3天半量换液。当细胞达70%~80%汇合时，用0.125%胰酶常规消化，细胞按照1：3进行传代，实验中使用2或3代细胞。2 @8 o9 k5 u+ [9 r; j' o

; }( V* w* I8 C( L7 p4 V+ t成肌诱导
- ^' L6 B7 g$ H2 或3代MSCs按1×105个细胞/孔接种于6孔板，以扩增培养液贴壁12小时后，换为成肌诱导液培养：DMEM、2% FCS、5%马血清（horse serum，HS）、50 µM氢化可的松（hydrocortisone）和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。该诱导培养液每3天半量换液。7 s; C3 c- F1 W; N

. ]( K! P9 b) s内皮诱导7 J/ m$ ^8 G8 a: x. Z
24孔培养板用Matrigel (factor reduced，BD Bioscience)包被，按5×104个细胞/孔接种MSCs。内皮诱导液为M199、2%FBS、50ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。

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kangzhoulab: 人骨髓、脐带血分离提取新方法：
9 }" N3 W& X3 S, H- W$ O) ?; m[分离、纯化后的干细胞检测] 4 |: @( s  Y7 ]( y  o
1、细胞存活率检测：使用溴芬蓝染色法。 6 f, C3 W* m' m6 N+ I: `
2、所提取的细胞总数计算 & b' ?- T3 Z. {# x
★细胞计数板计数法 ' Z3 a* I4 g8 X
★血球计数仪计数法 / o0 t5 C6 E2 }* j* A. M
3、干细胞的定性测定
3 I" ]1 @- i, z★培养扩增法
! z# x0 P' j9 G/ V8 E# p; }★流式细胞仪检测法，用已知抗原标记后测定。CD34+、CD117+、CD133+、C-kit+、 Sca-1+ / K$ y7 ^1 H5 |% x# E) g0 @6 e2 r. h
1 A% s' T- L8 W" |
    负收集混合法. N3 I9 k( g, T5 I( P$ G
分离的$ X: G; A( H* t# M( P9 F
原理   选择性的除去红细胞、血小板、全部的血浆物质、成熟的白细胞、
5 d4 E0 z( U. t1 L6 e淋巴细胞。保留Lin-细胞
" C" E8 i; N. y! i
# P% \! r* Q- g- H+ P1 J( R- B" h靶细胞表面标记物  无
: p6 B( S/ H6 l! d( g收集的靶细胞种类  能收集所有Lin-干细胞/祖细胞4 R5 v! c; r: |- N6 }

4 H( {( ~) H" e  q6 ^最小体积   0.5ml
" K6 [8 f$ Q5 M# b/ f5 C2 U; N; F动员剂   不需要
# e& o0 a1 H8 p血浆残留   无+ m' [, h) S  B; p; v5 N
分选对象   骨髓、脐带血
* d3 i# J9 L: p. [细胞
8 _# @( e: x0 O" [5 y回收率   ≥85%$ L1 f7 P- G. N; r/ {; O% t
细胞
  S- a% d# W4 A: \: `2 R( h7 C1 R$ w/ [存活率   ≥98%

missyoudad

thank u

2006goodluck

谢谢

athena1988620

好东西