求助：关于ips因子共转染细胞的问题

stemcell8

请问现在用的比较多的是逆转录病毒载体吧？关于这个载体有什么资料可以介绍一下么，我刚接触感觉很难理解，它是怎么测算病毒滴数的呢？四个因子一起转染怎么能算出它的转染效率呢？还有就是如何收集病毒因子并按比率配成转染试剂的，以及比例是如何确定的是按重量还是什么浓度啊？还有就是很多文献上红红绿绿的皮尔森指数是什么意思啊，刚刚接触看了几篇文献，实在是搞不明白，请论坛高手不要嘲笑小弟才疏学浅，多多帮助才是，在这里先谢谢各位了，希望大家耐心解答

stemcell8

盼望回复，多少说一点啊，攒个人气也好 谢谢

hansey

回复 1# stemcell8 - e& d& s3 K) w5 _

5 S+ _- a+ j& Y现在比较流行的还是Yamanaka的pMX的逆转录病毒载体，关于载体的信息可以在网上查到的。8 V' I  O) h. m$ j& V  n3 k
病毒滴度测定方法：1.在24孔板中测定病毒滴度，先用明胶包被24孔板10min以上。
3 ]! `, Q: h$ h3 [9 D. D* L消化293T细胞,24孔板每孔15万细胞。可将细胞做mix，体积扩大到15万细胞/500ul，加入1/1000 polybrene终浓度10ug/mL ，混匀，每孔加入500ul 15万细胞即可。0 H( X& O9 P3 a8 g7 S# O
2.将病毒上清4000rpm离心5min，将细胞碎片离至管底。取5ul病毒上清至上述步骤中传入15万每孔的24孔板一孔中，摇匀；48h后即可在荧光显微镜下观察其滴度。
! G7 y/ ~/ q( R) X* N: g6 O& t3.15万293T细胞48h即可刚好长至90-100％满，此时即可固定细胞，计数确定病毒滴度 # N3 {) m6 M: W) b$ c: q
4.DAPI 染色5 Z- w7 n+ u! |) C: i% {& a9 _
5.病毒滴度（IU/mL）=荧光细胞占总细胞数的百分比÷5×1.5×104(10的4次方）×103 （10的3次方）

hansey

论坛上有一些protocol，你可以载下来好好看看细节问题

stemcell8

谢谢哦 就是刚接触真是搞得头很大

gormu

回复 2# stemcell8 & Q) x  q) }  i( h

' G' ]0 S+ a' W; r  @/ x" D; E
   你可以去问问北京干细胞库的人，他们也许能解答你的问题.

moon2000male2

先回答你第一个问题。IPS细胞研究简述：
% A# W2 \' b* N# P  O  `! G; U" l2 Y3 p2009年2月6日，德国波昂大学马克思普朗克分子生物医药研究所（Max Planck Institute for Molecular Biomedicine)在《Cell》杂志上发表了他们的研究成果：他们只利用一种转录因子，就成功完成IPS的诱导形成。领导这一研究的是著名的肝细胞专家Hans R.Scholer，他的研究小组在去年《Nature》发表的文章啊中发表的研究成果表明：当4个基因中的某个或某几个基因内源性表达水平较高时，减少导入这些基因的甚至不导入这些基因，也可以达到诱导体细胞成为IPS的目的。& @3 L7 A( |3 n/ j7 S
现在Scholer等人又将需要的转录因子数目从两个减少为一个：Oct4.其研究小组将Oct4以逆转录病毒为载体插入到小鼠神经干细胞，获得了ips细胞。Scholer的这一单因子研究去除了两个著名的致癌基因：c-Myc和Klf4.但是仍然需要可能永久修改细胞DNA的逆转录病毒作为载体。相类似的，2008年9月，Konrad Hochedinger的研究小组，使用腺病毒完成了ips的诱导形成，而腺病毒的特性即不整合入宿主细胞基因组。

moon2000male2

再回答你第二个问题：四因子转录诱导ips系统，以及病毒滴度测定
$ ]. t+ C; B# M3 }( S5 i! c0 R现在常用的ips诱导系统，和三楼hansey大大说的一样，Yamanaka的pMX的逆转录病毒载体。  V, w1 s/ `" i0 h# g
即将表达，Oct4，sox2，c-myc，klf4，Naong的逆转录病毒载体（其实慢病毒或腺病毒载体都可以），导入成纤维细胞，通过Fbx15，Nanog 或者Oct4的表达形态学筛选，在胚胎干细胞的培养条件下，获得ips细胞。导入表达这些基因的慢病毒或腺病毒载体后，需要在目的细胞上检测相关基因的表达丰度（rt-qPCR 和 WB）以证明转录因子的正常表达。
3 c7 Q  S( {6 ~9 O* p4 x3 U6 M  e! f
关于病毒滴度测定：用qPCR法，因为这些转录因子的基因片段比较大，如果接在带GFP的载体上，很容易出现荧光丢失。或者DAPI染色。但两者是物理滴度，实际的有效病毒颗粒数没有这么多。
  q8 V* ^& c" N0 U: o- B& N8 ~& T: c& l+ }: r/ C  k
最后实验需要试错摸条件，不是那么容易获得想要的结果。尤其不知道你们实验室对慢病毒和腺病毒的掌握是否熟练，否则光这一关，就很不容易。

stemcell8

谢谢hansey,moon2000male2 的耐心回答

stemcell8

谢谢hansey,moon2000male2 的耐心回答