人胚胎干细胞的体外定向分化

雪原

刘卫东，任彩萍*，姚开泰*(中南大学肿瘤研究所，长沙410078)
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8 l' V6 c* J* N- j4 s, v摘　要：人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)由囊胚期胚胎内细胞团分离培养获得，具有保持未分化状态的无限增殖能力。hESCs 具有多向分化潜能，在体内和体外均可分化形成所有三个胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的衍生物。hESCs 一般在鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)饲养层上培养和扩增。为了优化培养条件，目前人们已发展了多种人类细胞饲养层和无饲养层、非条件培养基体系。hESCs 可以在体外定向诱导分化为多种细胞类型，为揭示人胚早期发育机制和发展多种疾病的细胞移植治疗奠定了基础。hESCs 可以在体外进行遗传修饰，将有助于揭示特定基因在发育过程中的调控和功能。对hESCs 的深入研究将极大地推动医学和生命科学的进展，并将最终应用于临床，造福人类。关键词：人胚胎干细胞；定向分化；遗传修饰& g0 \0 B! s+ p3 p; L+ C

7 D; E1 j8 b4 z* Q& }( p/ zIn vitro directed differentiation of human embryonic stem cellsLIU Weidong, REN Caiping*, YAO Kaitai*(Cancer Research Institute, Central South University, Changsha 410078, China)Abstract: Human embryonic stem cells (hESCs) can be derived from the inner cell mass of blastocyst embryo and propagate infinitely in an undifferentiated state. hESCs display pluripotency and can be differentiated into derivatives of all three embryonic germ layers (ectoderm, mesoderm and endoderm) both in vitro and in vivo.Generally hESCs culture requires mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells to maintain the undifferentiated state. In order to optimize the culture conditions, human feeder cells and feeder-free, unconditioned culture systems have been developed. In vitro, hESCs can be directed to differentiate into various cell types, which lays a foundation for cell transplantation therapy and clarification of the human embryonic development. hESCs can be genetically modified in vitro, which will help to elucidate the specific genes' regulation and functions in embryonic development. Deeper studies of hESCs will greatly further the progression of medical and life sciences,and will be finally applied in clinical medicine to benefit mankind.Key words: human embryonic stem cell; directed differentiation; genetic modification& @2 j' x1 Q1 U4 W

* p- X6 E7 c; Y0 }8 M: r7 s胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)，尤其是hESCs 的建立、研究和应用在国际学术界引起巨大轰动，被认为是继“人类基因组计划”之后，医学、生命科学上的又一革命性进展。 hESCs 一般来自由体外受精卵发育成的囊胚期胚胎的内细胞团[1-2]。这些细胞具有正常的核型；表达高水平的端粒酶活性。端粒酶是一种可使细胞无限分裂的 RNA依赖性DNA聚合酶，负责维持染色体长度，为永生化细胞所特有，分化细胞内一般无此酶活性。 hESCs 的多能性在体内和体外都被得到证明。在体内，将hESCs 注射入免疫缺陷小鼠，形成含三个胚层衍生物的畸胎瘤[1]；在体外，将hESC 悬浮培养导致形成拟胚体(embryoid body, EB)。EB 中的细胞分别具有三个胚层特异的分子标志物。hESCs可在体外诱导分化为神经细胞、角质形成细胞、心肌细胞、内皮细胞、造血细胞、肝细胞、胰岛β 细胞、滋养层细胞等多种细胞类型。在研究人胚胎发育和疾病发生、器官和细胞移植治疗、基因治疗、药物筛选与新药开发方面，hESCs 具有广阔的应用前景。 $ B0 F1 H% y# m$ B; P) a6 Y
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1　hESCs 的来源、培养和扩增囊胚期胚胎由内细胞团和滋养外胚层组成。前者将产生胚胎的所有组织和胚外结构，后者形成胎盘。hESCs 一般来自囊胚的内细胞团。首先用免疫外科方法去掉囊胚外围的滋养外胚层， 再将内细胞团平铺于经γ-射线或丝裂霉素C处理的MEF饲养层上，在高血清浓度条件下培养数天后，ESC 集落开始形成，此时须将ESC 集落转移至新鲜的MEF 饲养层[1-2]。此后为防止分化，须大约每隔7d 进行分散和重新平铺，分散的方法可以是微吸管机械分散，也可以用IV 型胶原酶消化分散。在MEF饲养层上或在MEF条件培养基中培养的 hESCs 不可能应用于临床治疗，因其有可能将异种生物病原体由小鼠转移至人类组织。为解决这一问题，人们研究发现了多种可以维持hESCs 未分化状态扩增的人类饲养层细胞，包括人胎儿肌肉、人胎儿皮肤、成人输卵管上皮饲养层[3]、人类包皮饲养层[4]、人类子宫内膜饲养层[5]、成人骨髓基质细胞[6] 和分化的hESCs[7-8]等。 目前尚未发现与这些饲养层相关且能维持hESCs 自我更新的共同的活化因子。为避免异种生物污染，Ellerstrom等[9]发展了一种无异种生物培养基，建立了无异种生物人包皮成纤维细胞饲养层，并用酸性Tyrode’s 溶液溶解法代替常规的免疫外科方法分离内细胞团，由此得到的无异种生物hESC系SA611表达未分化状态标志分子，具正常双倍体核型及体内外多向分化潜能，已传三十多代并可冷冻保存。传统的hESC培养方法需不断制备和鉴定MEF饲养层，不利于大规模培养hESCs。为此，Xu 等[10] 利用由细胞外基质，如Matrigel 或laminin(层黏素)组成的无饲养层体系培养hESCs 并取得成功，但这种方法仍然需要MEF 条件培养基。Xu 等[11]发现在非条件培养基中，碱性成纤维细胞生长因子bFGF 和BMP 信号拮抗因子noggin 协同作用可以维持 hESCs 未分化增殖，同时可以维持hESCs 的正常核型和体内外发育潜能。这一发现对于揭示hESCs 自我更新的分子机制和简化hESCs 培养都具有重要意义。目前，无饲养层、非条件培养基体系已成为很多实验室的常规方法。, u( m. F3 d, Q: `8 \& Z
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0 Y: U. K: N0 S/ L, _: O, \2　hESCs 的体外定向分化2 . 1 　神经细胞　在含有胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、肝素和FGF-2 的DMEM/ F12 培养基中培养EB, 其中心部位形成玫瑰花结，与早期神经管十分相似，并表达神经标志抗原 nestin 和Musashi-1。用dispase 进行酶处理，结合基于不同黏附力的分离方法，可以将中心部位的神经管样玫瑰花结从周围的扁平细胞分离出来。撤除 FGF-2, 平铺于鸟氨酸和层黏连蛋白底物上，这些 hESCs 来源的神经祖细胞可以体外分化成CNS所有三种主要细胞类型，即神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞。大部分神经元呈谷氨酸能表型，少部分被γ-氨基丁酸(GABA)抗体标记，还有少量神经元表达一种多巴胺合成的限速酶——酪氨酸羟化酶 (tyrosine hydrolase, TH)。移植入新生鼠侧脑室后，这些神经祖细胞被整合进不同的脑区，包括大脑皮层、海马、嗅球、间隔、丘脑、下丘脑、纹状体、中脑、胼胝体、内囊和海马纤维束等。在这些区域， 神经祖细胞分化成神经元和星形细胞，且没有发现畸胎瘤的形成[12]。Reubinoff 等[13]用含重组人EGF 和bFGF 的培养基培养hESC 集落，这些细胞集落发育成圆球体，球体中99%的细胞表达NCAM，97%的细胞表达中间纤维蛋白nestin。球体中的神经祖细胞在体外可分化为星形细胞、少突神经胶质细胞和成熟神经元。移植入新生鼠脑室后，大量细胞整合入宿主脑实质，并分化成三种神经系。移植的细胞可沿已经建立的迁移路线迁移，并以区域特异性方式分化，表明它们可对位置信息发生反应，并参与宿主脑的发育进程。除神经祖细胞外，hESCs 还可被诱导分化为特定的神经元亚型。其中多巴胺神经元由于可用于帕金森氏病的移植治疗而引起人们的广泛关注。将 hESCs平铺于基质细胞MS5或MS5-Wnt(转染Wnt基因的MS5 细胞)饲养层上，可形成玫瑰花结神经上皮结构，表达神经标志分子Pax6、nestin、NCAM 和Sox1。机械分离玫瑰花结集落，重铺于多聚鸟氨酸/ 层黏连蛋白包被的盘中，在含SHH (sonic hedgehog)和FGF8 的N2 培养基中培养，接着在含 SHH、FGF8 并补充胶质细胞系来源的神经营养因子、二丁酰cAMP 和转化生长因子β3 的N2 培养基中生长，第二次传代的细胞分化后，30% — 50% 的细胞为Tuj1 阳性神经元，其中64% — 79% 的细胞表达酪氨酸羟化酶。 免疫细胞化学检测显示细胞在分化过程中依次表达中脑多巴胺神经元标志分子 Pax2、Pax5 和engrailed-1。电镜分析显示10% — 20%的细胞形成不成熟突触接触，2% —4% 的细胞形成成熟突触。反向HPLC 显示基础的和KCl 诱导的多巴胺释放。在65%的细胞中可检测到去极化诱导的动作电位，且该动作电位可被河豚毒素阻断。这些数据表明可在体外自hESCs 获得功能性中脑多巴胺神经元[14]。Yan 等[15]通过在不同阶段使用FGF8 和SHH 处理神经上皮细胞分别获得前脑和中脑多巴胺神经元。使用FGF8 和SHH 是基于在多巴胺神经元发育过程中需要峡组织者(isthmic organizer)合成的这两种分子的作用[16-17]。此外，用一种简单的无血清悬浮培养体系也可以使hESCs 分化成多巴胺神经元[18]。将这种分化的细胞移植入6-羟基多巴胺损伤的鼠脑中(鼠帕金森氏病模型)，8 周后可在纹状体检测到存活的hESCs 来源的TH 阳性神经元。hESCs 还可以体外诱导分化成运动神经元。用化学限定的贴壁集落培养体系使hESCs 分化成神经外胚层，再用视黄酸(retinoic acid, RA)和FGF2 处理，在含RA和SHH 的培养基上分化，最后在培养基中加入BDNF(brain-derived neurotrophic factor)、 GDNF(glial-derived neurotrophic factor)和IGF-1(insulinlike growth factor-1), 并降低SHH 的浓度。这种体外生成的运动神经元具电生理活性，与邻近神经元形成有功能的突触，可诱导乙酰胆碱受体的群集，并可建立有功能的神经肌肉传递[19]。Lim等[20]研究了三株hESC 系经EB 培养分化为运动神经元的方法，发现RA和SHH联合处理EB可使分化效率提高三倍以上，分化的运动神经元均表达特异标志分子 HB9。而Wnt3A和骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)对RA和SHH的诱导分化作用具有明显的抑制效应。自hESCs 生成的功能性运动神经元可以用于运动神经元相关疾病，如肌萎缩性侧索硬化症的药物筛选，也可以用于运动神经元疾病或脊髓损伤的细胞替代治疗。2.2　星形细胞　中枢神经系统主要由神经元、小神经胶质细胞和大神经胶质细胞组成。星形细胞是大神经胶质细胞的主要类型，在中枢神经系统发育过程中有着广泛的支持功能。cyclopamine 是hedgehog (Hh)信号通路的抑制子，用cyclopamine 处理hESCs，随后在人星形细胞介质中培养，可导致hESCs 向星形细胞分化。分化的细胞表达星形细胞特异的标志分子胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，同时也表达神经标志分子nestin。神经营养因子，如胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF) 的表达水平也明显高于未经处理的对照细胞[21]。2.3　黑素细胞　表皮黑素细胞保护皮肤免受紫外线伤害，其缺损可导致白化病、花斑和白斑等。Fang 等[22]利用Wnt3A、endothelin-3 和干细胞因子等生长因子在4 — 6 周内使hESC分化成黑素细胞群落。这些细胞表达黑素细胞标志分子，如小眼相关的转录因子和酪氨酸酶，发育出黑素体并产生黑色素。当整合进人重建皮肤时，它们象表皮来源的黑素细胞一样，聚集在沿基底膜的适当位置，移植入免疫缺陷鼠后仍保持稳定的表型。2.4　角膜上皮细胞　角膜位于眼睛前部，由一复层上皮所覆盖。角膜上皮由位于缘区的干细胞不断更新。角膜干细胞则在缘微环境(壁龛)提供的各种因素中维持。由于该壁龛对于角膜干细胞十分特异，可以假设体外复制这些因素将导致hESCs 向角膜上皮样细胞分化。事实上， Ahmad 等[23]在Ⅳ型胶原包被的盘和缘成纤维细胞条件培养基中培养hESCs, 导致其多潜能性丧失并向上皮样细胞分化。扫描电镜观察发现hESCs 分化的细胞和缘上皮细胞一样具有很多微纤毛，但比缘上皮细胞要小得多。在hESCs 分化的过程中，Oct-4 和Nanog 的表达明显下降， SSEA4 的表达也急剧下调；而p63、CK3 等上皮特异基因的表达则相继上调。集落形成效率分析表明，从开始培养到第7d，集落形成效率逐渐上升，之后开始迅速下降，与p63 的表达变化相一致。2.5　角质形成细胞　H9 细胞注射至SCID鼠2 个月后形成含角质形成细胞的团块，团块经胰酶消化并接种入含经辐射的3T3 细胞和FAD 培养基的平皿中，形成的集落具角质形成细胞的形态学特征并表达p63、碱性核蛋白和K14。继续培养20d 后发生7分层和终末分化并表达K14和外皮蛋白。由hESCs 形成的EB中也含有向角质形成细胞系分化的细胞，这些细胞自EB 周边向外迁移。迁移的细胞首先失去Oct-4 表达，接着依次表达p63、K14 和碱性核蛋白。最后，与3T3 细胞共培养导致终末分化及其标志物外皮蛋白的表达[24]。 Ji等[25]也自EB培养获得表达K14 的角质形成细胞，这些细胞在含氢化可的松的培养基中可以传代，加入钙离子后可诱导分层和终末分化。角质形成细胞的制备将在伤口愈合治疗中发挥重要作用。2.6　心肌细胞　用hESCs悬浮培养方法形成EB，平铺于明胶包被的盘中，4 — 22d 后约8.1% 的EB 中出现按节奏收缩的区域。这些自发收缩的细胞可用机械方法进行分离，分离的心肌样细胞大多是单核的，呈圆形或杆状，含不同程度的肌纤维组织。在某些细胞中可观察到Z带，在许多分化的EB中还可观察到由缝隙连接和桥粒组成的闰盘。用免疫细胞化学方法可检测到α / β 肌球蛋白重链、α 肌动蛋白、心脏I 型肌钙蛋白(cTnI)、结蛋白(desmin)和 ANP，但伴肌动蛋白(nebulin)染色呈阴性，说明所检测细胞具心肌特性而非骨骼肌[26]。另一篇报道用相似的EB 培养方法获得心肌样细胞，其产生心肌样细胞的EB比例高达70%。此外还发现用5- 杂氮- 2- 脱氧胞苷处理可以加强心肌细胞分化，而DMSO 或视黄酸则无此作用[27]。Norstrom等[28]用EB 培养方法获得心肌样细胞，自发跳动的细胞群落占EB总数的30%。这些细胞群落可以分散成单个细胞悬液并可冷冻保存。用电镜可观察到Z 盘和紧密连接；用免疫组化分析可检测到心脏特异分子的表达。药物学刺激可导致肾上腺素能和毒蕈碱能受体偶联系统的反应。Yoon 等[29]则发现悬滴培养结合5- 杂氮胞苷处理可大幅度提高hESCs 向心肌细胞分化的效率。这一发现也说明基因的甲基化状态在心肌发育过程中扮演重要的角色。Pal 和Khanna[30]自两株不同来源的hESC系用相同的方法获得EB, 接着用含低浓度胎牛血清的培养基培养，并加入BMP-2, 由此获得的心肌细胞表达心脏基因和蛋白，并对功能分析发生反应。在培养的EB 中加入noggin 可拮抗 BMP-2 的诱导作用。( J6 M" Z8 u' q' |1 ?% D
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0 i2 J2 d* {6 {共培养方法也可用来从hESCs 产生心肌细胞。 Mummery 等[31]将hESCs 与鼠内脏内胚层细胞END-2 共培养，15% — 20% 的培养物形成跳动的心肌集落。这些细胞对药物的反应和动作电位的特性类似于人胎儿左心室心肌细胞，而与鼠心肌细胞则不同[31-33]。hESCs 向心肌细胞的分化研究为心肌梗塞等心脏疾病的细胞移植治疗带来了新的希望。Capi 和 Gepstein[34]对hESC 来源的心肌细胞应用于临床再生医学的策略进行了详细而深入的探讨。2.7　内皮细胞　EB形成也被用作内皮衍生物分离的起始步骤。在EB中可观察到内皮标志分子的表达随时间而增强，这些标志分子包括PECAM1(CD31)、血管内皮钙黏连素(VE-cad 和CD34)、血管内皮生长因子受体２(VEGFR-2)、Tie-1、GATA-2、GATA- 3，以及血管/ 造血祖细胞表面标志分子AC133/ CD133。在EB 中，这些内皮细胞不是呈单个细胞存在，而是组织成特定的通道，表明hESCs 可自发分化为内皮细胞并形成血管样结构。用抗内皮标志物PECAM1的抗体标记后通过FACS可分离EB中的内皮细胞。当分离的PECAM1 阳性细胞在基质胶上培养时， 可形成类似血管的管样结构。将 PECAM1 阳性细胞移植入SCID 鼠的皮下组织，可形成具人PECAM1 和CD34 免疫活性的微血管，其中的一些还含有鼠的血细胞[35]。2.8　造血细胞　成体造血干细胞(HSC)移植是现今应用得最普遍的细胞移植治疗。HSC 主要源自骨髓、外周血和脐带血，目前有约2/3 的患者得不到匹配的供体。hESC 的建立为此类移植提供了新的来源。为促进造血细胞生成，未分化的H1细胞与经辐射的鼠骨髓基质细胞S17 或鼠卵黄囊内皮细胞C166 共培养。培养介质含20% 的胎牛血清(FBS)，但无其他外源细胞因子或生长因子。17d 后，经流式细胞计数分析，约1% — 2% 的细胞为CD34 CD38-，与早期造血细胞表型一致。在CFU试验中，每105 个H1/ S17 细胞可产生30.4 个集落，每105 个H1/C166 细胞可产生4.3 个集落。两者都可产生红系和髓系集落。CD34  细胞可以通过MACS 富集。这种选择可以增强CFU 形成，形成的集落包括红细胞、巨噬细胞、粒细胞和巨核细胞集落[36]。在EB的发育过程中用一组细胞因子结合BMP-4 进行处理，可以强有力地促进造血分化，诱导形成的造血祖细胞可以产生红系和髓系衍生物。这些细胞因子包括干细胞因子(SCF)、IL-2、IL-3、粒细胞集落刺激因子(GCSF)和Flt-3 配体[37]。在细胞因子和BMP-4 的基础上加入血管内皮细胞生长因子A (VEGF-A)可进一步加强hESCs 向红细胞分化[38]。 Bowles等[39]发现用脂质转染法将转录因子HOXB4基因导入hESCs 可显著增强hESCs 的造血发育，且这种分化无需加入其他的细胞因子。Qiu等[40]报道人胎肝来源的细胞系FH-B-hTERT 诱导hESCs 分化成造血细胞的效率比S17 细胞高。 S17 和FH-B-hTERT共培养体系均能重现发生在卵黄囊发育期的珠蛋白转换，它们产生的红系细胞首先主要表达ε 珠蛋白mRNA, 接着转为主要表达γ 珠蛋白mRNA，而不合成任何β 珠蛋白mRNA。将hESC 与鼠基质细胞系OP9 共培养，能同时产生CD34 造血细胞和CD73 间充质干细胞(MSC)，两者生成的时间动力学几乎完全相同。分离的 CD34  细胞能形成造血细胞集落。纯化的CD73  MSC具典型的骨髓来源MSC的形态学特征和细胞表面标志，能够向成骨细胞、成脂肪细胞和成软骨细胞分化[ 41]。2.9　软骨细胞　Hwang 等[42]用EB 培养方法高效地自hESC 获得间充质样细胞。这些细胞表达间充质干细胞表面标志分子，包括CD29、CD44、CD105 和血小板来源生长因子受体α (PDGFR-α)。当这些细胞包埋在精氨酸- 甘氨酸- 天冬氨酸(RGD)修饰的聚乙二醇水凝胶中，并结合TGF-β1 处理时，可观察到新形成的软骨。该软骨中有嗜碱性细胞外基质沉积，软骨特异的分子如Ⅱ型胶原、Aggrecan 和连接蛋白(link protein)等的表达明显上调。最近的一项研究比较了EB直接平铺向外生长体系和EB来源的高密度小团块体系对hESCs软骨形成分化的影响，发现两者均可导致软骨形成，但 Col2、Col1 等基因表达的时相有很大差别，Ⅱ型胶原的沉积和硫酸氨基葡聚糖的累积也有较大差异。在对照条件下均有明显的Col1、Col2a1、link protein 和Sox9 等基因的诱导表达，而BMP-2 处理能进一步增强这些基因的表达。对照条件下可检测到内源性BMP-2 表达，这可能是对照培养中软骨形成分化的诱导因素[43]。2.10　肝细胞　肝细胞分化研究在肝硬化等疾病的移植治疗及药物筛选方面有重要的价值。在丁酸钠的处理下，hESCs 可经EB 或被直接诱导分化成肝样细胞，同时也有明显的细胞死亡。分化的细胞在形态学上与原代培养肝细胞相似，70％— 80%的细胞表达肝相关蛋白如白蛋白、AAT、CK8 和CK18， 70%—76%的细胞积累糖原。EROD分析表明H1和 H9 hESC 来源的肝样细胞均具有可诱导的细胞色素 p450 活性，说明分化细胞具成人肝细胞的功能特性。研究表明丁酸钠可能是通过其组蛋白脱乙酰酶抑制剂的作用介导干细胞的定向分化，因为用另一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂trichostatin A 对hESCs 进行诱导，也得到相似的分化结果[44]。Lavon 等[45]用EB培养方法获得肝样细胞。他们将肝特异的白蛋白基因启动子与eGFP 基因融合，再将此ALB-eGFP融合基因转染hESCs。EB培养20d 后，可用共聚焦显微镜检测到eGFP 阳性细胞，免疫染色显示这些细胞同时表达白蛋白。EB 中的 eGFP 阳性细胞可用FACS分离并继续培养扩增。他们还鉴定了几种生长因子，如aFGF、bFGF、BMP-4 和HGF 等对肝分化的影响，发现只有aFGF 具明显的促分化效应。2.11　胰岛β 细胞　1 型糖尿病一般源自胰岛β 细胞的自身免疫性损坏及由此导致的胰岛素绝对缺乏，目前一般依赖于外源胰岛素治疗。移植治疗是一种全新的治疗方案，其主要障碍是胰岛素生成细胞来源有限。hESCs 的分离为获得足够的β 细胞以进行移植治疗带来新的希望。 用EB培养方法和免疫组化染色观察到，60% — 70% 的hESCs 来源的EB 中，平均1% — 3% 的细胞呈胰岛素染色阳性[46]。这些细胞分散在整个EB 中或组织成小的集落，并表达对β 细胞功能有重要作用的基因GLUT1 和GK。但另一项研究认为这1%—3%的胰岛素阳性细胞可能从培养基中吸收富集胰岛素，而并不从头合成和分泌胰岛素，因为用RT-PCR 没有检测到insulin-1 的表达，insulin-2 mRNA 的转录也很微弱，而且检测不到胰岛素从头合成的副产物C 肽的表达[47]。Segev 等[48]自hESCs 获得了由胰岛素生成细胞组成的不成熟岛样集落。首先用悬浮培养生成EB，并平铺于胰岛素- 转铁蛋白- 硒- 纤维结合素(ITSF) 培养基中，再在含bFGF、N2 和B27 的培养基中扩增胰腺前体细胞。接着降低培养基中的葡萄糖浓度，撤消bFGF，加入烟酰胺。最后，分离细胞并悬浮培养以使细胞继续生长，形成细胞集落，其胰岛素的分泌达到225.8±78μu/ml/105cell/hour。将这些细胞在含葡萄糖的培养基中孵育，随着时间的延长，培养基中积累的胰岛素逐渐增加，60min 后达到最高值。RT-PCR 检测到一系列胰腺基因的增强表达。免疫荧光检测显示这些细胞共表达胰岛素和C 肽，表明了无可否认的胰岛素生成。除胰岛素外，大多数细胞还共表达胰高血糖素或生长抑素，提示这些细胞类似不成熟的胰腺内分泌细胞。进一步的研究和改进将完善胰岛素生成细胞的制备以作为移植治疗的无限制细胞来源。2.12　生殖细胞　Chen 等[49]建立了三株台湾人来源的hESC 系，在研究其自发分化的过程中发现这些细胞系分化的细胞除表达三个胚层的标志分子外，还检测到生殖细胞标志分子的表达，包括c-kit 、 STELLA、VASA 和GDF9。这表明hESC 可能有向生殖细胞分化的潜能。2.13　滋养层　用重组人BMP-4 处理hESCs，可使其分化为滋养层，其特征为扁平、扩大的细胞和增殖减少。加入BMP 信号抑制子如可溶性BMP 受体或BMP 拮抗蛋白noggin，可阻断由BMP-4 诱导的形态学改变。BMP-4 处理单个的ESC可观察到多核细胞的形成，其形成方式是细胞融合而非核内倍增。cDNA 微阵列和RT-PCR 分析表明BMP-4 处理 7d 后，滋养层或胎盘标志基因，如CG-α 、CG- β 、黄体化激素β 、胎盘生长因子、GCM1、HLAG1 和CD9 的表达均显著上调。BMP-4 处理的H1细胞与未分化细胞相比，其分泌入介质中的胎盘激素 CG、雌二醇和孕酮的浓度也明显升高。该研究为进一步阐明滋养外胚层的分化机制提供了一个很好的模型[ 50]。
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3　hESC的遗传修饰 hESC的遗传修饰是了解和影响其生物学特性的重要手段。导入影响hESCs 存活、扩增、分化、免疫原性或内源基因表达的基因于临床也是十分有用的。目前，hESCs 遗传修饰的方法主要有脂质体转染、电穿孔转染( 同源重组) 、病毒载体转导和 siRNA 干扰等。Eiges 等[51]利用TK 启动子和荧光酶报道基因构建成表达载体，分别用三种基于脂质体的试剂 Lipofectamine(Life Technologies)、FuGene(Boehringer Mannheim)和ExGen 500(Fermentas)进行转染实验，发现ExGen 500 的转染效率最高。接着，用ExGen 500转染方法，Rex1-EGFP表达载体被转染入hESCs 中，获得的稳定转染率为10-5。随着hESCs 在形成 EB的过程中自发分化，GFP表达逐渐减弱直至停止表达。Ren等[52]发现在表达EBNA1的hESCs中，EBV 潜伏期复制起始序列oriP 能轻微地提高瞬时转染效率，且与不含oriP 的质粒载体相比，其稳定转染的效率提高近1 000倍。通过含oriP的质粒表达shRNA， EBV载体系统还能够有效地提高hESCs中的RNA干扰效率。用脂质体方法可有效地实现瞬时表达和随机的稳定整合，但难以获得特异的基因打靶事件。根据 hESC和鼠胚胎干细胞(mESC)的细胞大小改变电穿孔参数，对成团的ESCs 而不是单个的细胞进行电穿孔，并改用等渗的、蛋白质含量丰富的标准细胞培养液代替PBS。Zwaka 和Thomson[53]成功地利用同源重组对HPRT1基因和POU5F1基因实现了基因打靶。在转染了HPRT1 和POU5F1 基因的细胞中，同源重组的比率分别为2% 和27%。另一种相当成功的方法是通过使用自我失活的慢病毒载体获得稳定的转基因hESCs。利用水泡性口炎病毒G 蛋白(vesicular stomatitis virus G, VSV-G) 包装慢病毒载体，产生的VSV-G假型载体大大增强了转导效率，具广泛的亲嗜性且能被超速离心浓聚而不变性。在不同的MOI (multiplicity of infection) 条件下，稳定转导eGFP 的效率可以达到20% — 80%。在hESCs 自发分化为三个胚层的衍生物或定向分化为造血细胞的过程中，表达eGFP 的细胞比率仍然维持较高水平[54-55]。VSV-G 假型慢病毒载体在高效转导hESCs 的同时也高效转导MEF细胞，这使随后的分析和研究复杂化。鉴于此，Jang 等[56] 发展了长臂猿白血病病毒(GALV)和猫内源性病毒 (RD114)糖蛋白包装的GALV 假型慢病毒载体和 RD114 假型慢病毒载体，两者都可以选择性地转导 hESCs 而不转导MEF 细胞，且在hESCs 分化过程中保持转导的稳定性。为阐明控制hESCs 多能性、自我更新和细胞分化的分子机制，了解单个基因产物的功能和调节是极其重要的。目前，siRNA 已被成功地用于hESCs 中基因的下调研究。应用这种方法， Matin 等[57]和 Hay 等[58]发现Oct-4 而非β-2 微球蛋白的表达下调可以导致hESCs 的分化。Zaehres 等[59]利用逆转录病毒和慢病毒载体将siRNA 导入hESCs 中，使eGFP 转基因和Oct-4、Nanog 转录因子高效沉默。Oct-4 和 Nanog 的基因沉默促进分化，表明它们在hESCs 自我更新过程中具有关键作用。4　总结综上所述，hESC 及其体外分化模型能够模拟人胚正常发育进程，为人胚发育机制的研究和多种疾病的移植治疗提供了新的思路；但要应用于临床，还存在一些技术上的问题。主要包括以下几个方面：(1) hESCs 很容易自发分化为其他细胞，如何维持高效的体外扩增而不发生细胞分化仍需进一步研究干细胞的培养条件。(2)如何高效、特异地定向诱导分化及如何获得高纯度的分化细胞尚需进一步研究。ESC 有形成畸胎瘤的倾向，因而有必要对 ESC 及其衍生细胞移植的安全性做一全面客观的评价。(3)要使ESC 在体外发育成完整的器官尚需技术上的突破：因为器官的形成是非常复杂的三维过程，很多器官是由两个不同胚层的组织相互作用而形成的。(4)目前，由体细胞克隆hESC 尚未获得成功。这一技术的突破将有助于解决细胞移植的免疫排斥问题。来自肿瘤、神经变性等疾病患者的疾病特异干细胞对药物筛选方法极其有用，但目前尚未取得突破性进展。(5)很多证据表明，肿瘤来源于肿瘤干细胞，而肿瘤干细胞是来源于成体干细胞还是祖细胞或者终末分化的细胞，目前尚未得到直接的证实。很多正常发育过程中起作用的细胞信号分子，如BMP、Notch、Wnt 等在肿瘤进程中亦有关键作用，如何应用hESC 进行肿瘤发生发展机制的研究还有待进一步的探索。随着上述问题的解决，hESC 必将极大地推动生命科学和医学基础领域的研究，也必将为多种疾病的临床治疗带来新的希望，从而造福人类。
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致谢：徐仁和、彭白露、张贺军等对本文的完成给予了大量的帮助，在此深表感谢。[参 考 文 献][1] Thomson J A, Itskovitz-Eldor J, Shapiro S S, et al. Embyronic stem cell lines derived from human blastocysts. Science,1998, 282: 1145-1147[2] Reubinoff B E, Pera M F, Fong C Y, et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol, 2000, 18: 399-404[3] Richards M, Fong C Y, Chan W K, et al. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human innercell masses and embryonic stem cells. Nat Biotechnol, 2002,20: 933-936[4] Amit M, Margulets V, Segev H, et al. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol Reprod, 2003, 68:2150-2156[5] Lee J B, Lee J E, Park J H, et al. Establishment and maintenance of human embryonic stem cell lines on human feeder cells derived from uterine endometrium under serum-free condition. Biol Reprod, 2005, 72: 42-49[6] Cheng L Z, Hammond H, Ye Z H, et al. 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horst

真是好资料，很有帮助，谢谢了

mijieyaer

好东西

sacia

很有收益，楼主辛苦了，谢谢！！

herry

非常感谢！

ruofan1982

谢谢楼主，我是最近才开始学习这个的，

mihugreen

楼主辛苦

恋水鱼

谢分享

jcb

Good job!" v1 j0 g/ s4 B4 `
but how can we prove that the so-called in vitro differentiated cells are indeed functionally equivalent to the vivo one. Expression of some marker genes is obviously insufficient.

yuguangju99

谢谢