|
- 积分
- 60
- 威望
- 60
- 包包
- 112
|
我也做这个，收集了一些资料：供大家参考；% \ K) n7 t D; Y ~
* O# L$ o$ D* c; J5 O8 q y1 N% T! _3 x( `7 D$ k
免疫磁珠法分离细胞（含步骤Protocal：）
& h# S H% n4 N2 G" \免疫磁珠法分离细胞原理：& a; Y% A$ j7 v& q9 ^" b6 W( h
免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。% W' o$ l& G5 q- V% ?: j7 B" D- k
0 X2 X' N \' g; UProtocal：
' b1 _2 c; H+ G% x X9 C
1 b2 }, i$ q' p) y. P! n1.离心收集待分离细胞，用少量PBE孵育液(0.5％BSA、0.08％EDTA PH7.2 PBS，真空抽滤除菌及液体内气体)充分混悬细胞(0.5ml/1×108细胞)，加入一抗(10~20μg/ml终浓度)，4° C孵育30分钟。 ! H" `7 }7 J% j3 _/ ~
2.用20倍体积PBE洗细胞一次，再加PBE(0.3ml/1×108细胞)充分混悬细胞后，加入相应二抗包被的超微磁珠，混匀后置8~15° C孵育10~15分钟。
; N, F- V/ {0 I( s' k3.将分离柱安装入磁场中，加入0.5ml PBE，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱。 / ], ?( P2 [7 p* j, _
: @( b0 f& r# m u# `: M
" _8 j% r; i; z* A注： 9 b* I$ C8 b7 |
2 ]) t) E. R) l& W
1.如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成。
3 Q7 e+ |# N4 Y; k7 n& ?1 y' |( w2.超微磁珠及微小磁场系统适合于少量细胞分离(如106-107)，通常已适用于大多数实验研究；此外各公司尚有大磁珠及大磁场供应，可用于更大量细胞的分选；除分离柱外，也有试管及其它设备用于分选；根据我们应用的经验，分离柱由于提供了较大的接触面，在细胞分选上具有较多优点。磁场也可以自制，用一般的磁铁即可做成简易磁场，可提供足够的磁力。 $ O i* s# t1 i: s7 N! x9 D5 e7 a
3.磁珠分离系统分离的细胞纯度可以达到80~99％，得率在60~90％左右，仅次或相当于流式细胞仪（FACS）的分选效率，与FACS 相比，MACS设备简单，耗时极短，故而应用广泛。MACS也可用做FACS分选前的预分离，以减少FACS所用时间。另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常可达95－99％。
0 ?* ]8 h+ [$ ]& r2 k8 y4.在分离柱尾接上限速针头，收集的首次流下的细胞即为阴性选择细胞，一般纯度低于阳性选择。 8 Z M3 V ]" P9 g* N( k0 W2 W
5.分离柱一般只能一次应用，再用时降低分离效率； . |4 j6 P7 v# D; U1 G$ ~
6.分选下的细胞可用荧光标记抗体(一抗或二抗)标记后FACS鉴定纯度；我们用荧光抗体直接标记细胞后，用二抗包被磁珠分选出细胞，直接做FACS分析，也可实现分选和纯度检测。 ' ~0 _. m, d8 l3 I" A
7.阳性选择后，如需用第二种表面标志继续分离，可以用剪切酶剪切下之结合的磁珠和一抗，再次进行下一轮分选。如需进行细胞功能分析，也可经培养12~24小时，使结合的磁珠脱落后进一步使用阳选的细胞做研究。& J$ [$ r* K; [7 P# g& I" c! Z9 z
1 O3 t' J4 O V3 I分选的效率在很大程度上取决于实验者对关键环节的把握。我们建议实验者在操作前认真阅读相应的说明书及以下特别值得提出引起重视的有以下几点：
' L @* R7 _. ^7 A& i4 \1.待分选细胞中如有贴壁细胞，建议在分选前先贴壁培养去除，或者提高EDTA浓度；
5 ~, ]' e. ?$ h" \2.抗体包被磁珠对死细胞常有非特异性结合。因而分选前去除死细胞；
" T/ ~" S( M$ p4 X6 D* ^1 I% C! e0 V3.新鲜分离骨髓细胞，先用胶原酶、DNA酶、胰酶联合消化，可使细胞团块解聚，从而提高分离效率。
% w R* i8 o" R9 Y4 }1 \" H4.上分离柱前，充分振荡，混悬细胞，打散细胞团块； 1 R/ V* W/ ~% }7 j4 R! {
5.用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞；
* s r. k. I; r7 f5 }6.细胞悬液加入分离柱中时，应将滴管伸至底壁后加入，避免将细悬液沿管壁流入，使管壁残流末分选细胞，以致后继洗柱过程中，因疏忽末被洗下，最后导致纯度不高。洗柱时，应在前次液体充分流尽后，再加洗液。
2 w+ r6 u. a% F, X7.分选细胞量应根据说明书控制，不超量；
! T Q1 p( A! _. X5 L) n8.孵育时间和温度应按说明书进行，延长孵育时间、提高温度会增加非特异结合； 8 k% X x1 j, ]' y* y
9.先用抗体阻断Fc受体，可降低非特异性结合；
1 R7 y; A4 `# x X" Y免疫磁珠法分为正选法和负选法：
; q: I( Q( o1 [0 k3 n. Y0 V$ l; Y1 |正选法－磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞% U% ]1 a! B! ]
负选法－磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞0 L+ o3 i! D% h
一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大
$ m2 t6 M" G3 k% r磁珠：* g, a2 U0 |6 L- V" b2 K
大小在0.1－0.45mm
8 f) e5 I" c- O3 N2 Q1 g包被了生产的高质量单抗( u+ }3 S z! c4 i6 ^
磁珠已为白细胞亚群的分选所优化
/ M# P; R7 T1 |% @# Y. `将包被了特异性单抗的BD IMag磁珠加入细胞悬液，磁珠特异性地与有相应抗原的细胞亚群结合，通过分离得到的连有磁珠的细胞可直接用于功能试验和用流式细胞仪检测。: P4 _6 V5 Z0 e6 S( d7 c. }8 I
磁分离细胞的重要指标是：/ c H3 i; e. H+ _% S" j3 k
纯度和得率，这取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太小的磁珠得率不高，太大的磁珠又会影响细胞活性，也无法直接上流式。; Y6 B8 ?' K* V3 v4 g
目前市场上有2种磁性细胞分离系统：
" z. V5 k s+ U1 z: tSmall particles (≈50 nm) － MACS 2 x W4 x% u4 @
Large particles (1200~4500 nm) －others（如Dynal）# i" V+ q g7 u3 o
- K+ m: W9 Y+ }0 @小磁珠 优点：& J2 j! M5 i6 ~ }' b& i, \
对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养 y% d s! e. T/ \) E
可直接上流式检测，不影响散射光; {+ h8 C, N4 P4 p' Q
小磁珠 缺点：
- \* d& `, K9 X3 J需要很强的磁场来分离细胞 h: p5 l, ~8 Q
分离速度慢，得率不高" Z3 A" E- |) Y4 B
需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行% u3 {8 e+ d6 G, Y2 B
成本昂贵
2 r7 }9 G5 v' P$ T大磁珠 优点：
, M8 I8 R" N" N5 O, L2 E$ w技术简单，分离可在试管中完成
7 {7 u- U, N* [/ D) m" W6 {( \易于增减细胞用量
/ W$ b( r; t2 f' E, G速度快，得率高
8 _+ q' n c- o+ L8 J成本低
7 G# D! R( t6 S; L大磁珠 缺点：
. r. l9 Z" {+ `对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养, M- |, g. T! g* X) Z/ F# {) P
纯度低
- O$ z0 N' D6 r }阻塞FCM的喷嘴
) Q& I) y x& _# I) t/ k: @7 {宁波良瑞抗体生物技术公司Ningbo Landlab Antibody Bioscience Company" `7 _0 {1 H2 b3 k. B# h! h6 P! R
E-MAIL：landlab@126.com商务电话：13857866023/13136368062，技术电话：13957881065" n4 v W9 ^9 R
吸收大磁珠和小磁珠分离系统的优点，引进直径约200nm中等大小磁珠。
0 f+ J- F _7 K: o; f/ Q2 }" ~7 k技术简单，分离在普通的试管中完成5 F% U D6 I1 |7 S* d' H
易于增大细胞用量. R; U- U G7 g/ J4 y: \
对细胞温和，不影响细胞功能及其分离后培养，可直接上流式8 j5 \3 {. m" l1 y
纯度高，回收率高
; @. T- g; N4 N5 [5 S/ J# M成本低 |
-
总评分: 威望 + 5
包包 + 10
查看全部评分
|
发表于 2010-3-30 17:35
